引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计(2)

4. 绘制引物设计示意图

注4：对于PHIP基因，我们顺利的得到了保守性区域分析结果。但是，对于某些进化较快的基因，保守性区域可能不足够用于设计引物。此时，可以逐渐减少用于分析的远缘物种，采用渐进性的分析，直到得到能够设计引物的保守性区域。

注5：为什么是mega ？保守性区域的分析用其他软件（如DNAMAN）也可进行。采用mega的原因在于其分析方法的可靠性更高，同时该软件在进化分析等中也非常常用，所以将mega可读序列的制作一并说明。 四． 用Primer5 软件设计引物 1. 新建文件，导入模板

确定一条序列为设计引物的模板序列。本例中根据进化关系，选择鸭的PHIP基因序列为模板。在Primer5软件中新建一个窗口（File → New → DNA Sequnce），将模板序列粘贴（ctrl+v）在窗口内（一般选择as is表示粘贴原序列，也可根据需要粘贴反向序列等）。

2. 设置参数，搜索引物 在新序列窗口中点击

按钮进入引物设计窗口，如下图。

在引物设计窗口中点击

按钮进入引物搜索窗口，如下图。引物类型为PCR Primers ，搜索类型一

般选择成对引物，在搜索范围内限制搜索上下游引物的序列区域（参考前面的保守区域进行设置），产物长度，引物长度设置详见后续介绍。搜索模式分为自动的Automatic和手动的Manual，在自动模式下引物搜索由严格标准往宽松标准执行，直至引物条数/对数达到设定值，其搜索参数设置如下图，搜索参数

为在搜索过程中排除不合格引物的筛选条目；在手动模式下，可设置搜索的严格程度，并可修改搜索参数条目下的限定数值。

在引物搜索窗口设置好后点击

按钮开始搜索，搜索结果如下图。在搜索结果中可分别查看上下游

引物或成对引物的情况。Rating值代表系统对引物的（产物）打分，分值越高说明引物越优秀，但并不是

绝对的评价标准。引物具体信息在点击引物所在行后在引物设计窗口显示，其中：上游或下游引物信息；

按钮为选择显示Seq No表示引物第一

个碱基在序列中的位置；Length表示引物/产物长度；Tm表示引物/产物的熔解温度；GC%表示引物/产物的GC含量；△G表示引物结合模板过程的自由能；Activity表示引物与结合的效率；Degeneracy表示引物的多义性；Ta Opt表示Primer5软件建议的成对引物扩增时的最佳退火温度。

Hairpin表示引物可能形成的二级结构；Dimer表示引物自身可能形成的二

聚体 ；False Priming引物与模板的错频；Cross Dime引物间可能形成的二聚体表示 。以上项目即为分析引物时的参考条目，引物设计的一些原则整理见后续。参照引物设计的原则即可根据Primer5中上述参数对引物对进行选择。

另，对于一些引物，可能出现大多数指标都较为优秀，但个别指标严重影响扩增反应的情况。这种引物可使用

按钮，手动的对其进行修改以提高其性能。

3. 引物设计原则

1) 引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于75℃，即Taq酶的最适温度。总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

2) 产物长度：扩增片段长度取决于酶的活性和保真性能。对于普通Taq聚合酶，PCR产物一般不超过2000bp，而在100-1000bp范围效果较佳，超过1000bp的产物就可能出现产物量降低甚至无法扩增的情况。对于其他酶，应根据相关说明使用。

3) 引物Tm值：引物的Tm值，指的是50%的引物分子和其互补序列表现为双链时的温度，PCR时的退火温度一般都要比Tm值低5℃左右以确保有效退火。引物的Tm值一般控制在55-65度, 一般需保证上下游引物的Tm值差不超过4-6度。如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。许多软件可以对Tm进行计算，其计算原理各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。 4) GC%：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，GC含量太高也易于引发非特异扩增。上下游引物的GC含量不能相差太大。GC%对扩增的影响主要通过Tm值来体现，当Tm值符合要求时，对于GC%不必做严格要求。另，引物序列中同一碱基连续出现不应超过5个。

5) 引物3’端：引物3’端是延伸开始的地方，最好不存在错配。同时3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。同时，3’端有形成二级结构/二聚体的可能对于PCR扩增的影响将大于5’端。在扩增编码区域时，引物3′端最好不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

6) △G值：引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低的引物，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应（寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol，通常就是专一性的探针或引物）。

7) 引物的二级结构/二聚体：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。另外，尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补，否则两个引物分子可能通过互补碱基而结合形成引物二聚体。一般情况下，引物形成的发夹结构和二聚体中不应多于4个连续碱基的同源性或互补性（实际常用自由能△G判断，△G为负值时，其绝对值越大不利影响越大，一般以小于绝对值4.5为标准（应远小于引物与模板结合的△G），为正值时则几乎无影响）（Oligo分析时的一般标准则为引物效率小于100或小于目的产物效率的三分之一）。个人观点认为，引物的二级（发夹）结构对于目的片段扩增的不利影响要大于引物二聚体（因为引物位置的二级结构在模板序列中是同样存在的。模板序列形成二级结构，在PCR过程中如果无法完全解链则将直接导致引物与模板结合的失败）。

8) 引物5’端：可以有与模板DNA不配对碱基。其应用有：5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基），5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究，5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）等。因此，在无法避免的情况下，引物5’端的出现的错配在一定程度上可以接受（也用自由能△G判断，标准与“引物的二级结构/二聚体”条目相同）。 4. 保存引物

通过File →Print可以保存引物的报告文件.pdf（需安装虚拟打印机）。

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