分子生物学(2)

2.原核RNA聚合酶：①在原核生物中，所有类型的RNA（mRNA、tRNA、rRNA）都由一种RNA聚合酶转录。 ②核心酶是由两个α亚基和一个β亚基，一个β′亚基组成，核心酶依靠静电作用力与DNA发生非专一性 与非特异性结合，负责RNA链的转录延长。 ③当核心酶与σ亚基结合就构成了RNA聚合酶的全酶，由于σ亚基的结合，使全酶的构想发生改变，全 酶依靠特定的空间结构与启动子特异的碱基序列发生专一性的结合，负责RNA转录起始。 3.增强子的结构与作用机制：

（1）增强子：是真核生物中远距离的正调控位点，通常包括组成型元件和可调节元件。 （2）增强子与启动子的区别：①增强子可以从非常远的距离使它的靶位基因转录活性增加达1000倍。②启动子只能在一个方向对邻近位置的下游基因进行转录发动，所以启动子的位置对其功能很重要。增强子没有启动子活性，但增强子的租用不依赖方向和位置，增强子可能位于基因的上游、下游甚至所调节的基因的内部，这是因为它是通过使内部DNA成环突出而实现与基本转录装 置相互作用。③增强子可以包含有功能的成簇的结合位点群，称为增强子元。他们可以调节多个启动子，在有些系统中引起增强子的竞争，增强子没有基因的特异性，即可以对增强子进行克隆，重组和转移。④增强子具有组织和细胞的特异性，这也意味着增强子的表达需要特异的蛋白因子的作用。 4.绝缘子的结构与功能：

（1）绝缘子：是一段具有特化染色质结构的区域，它能阻断增强子或沉默子对靶基因/启动子的增强或失活作用效应。而且能保护两个绝缘子之间的基因免受任何外界因子的作用与影响，形成一个特异的“真空地带”。

（2）绝缘子的功能：其一，当一个绝缘子位于增强子和启动子之间时，它可以阻断增强子与下游基本转录复合体的结合，从而消除增强子对启动子增强表达效应；其二，当一个绝缘子位于沉默子和启动子之间时，它能提供一道“屏障墙”，阻止沉默子的异染色质化区域的延伸，从而阻断沉默子对下游靶基因的失活效应。

4.5RNA的加工：

1.RNA加工：指新合成的前体RNA分子所经历的结构和化学方面的修饰与成熟过程。 2.加工的过程：

（1）RNA的5′端戴帽： ①由磷酸酶催化脱去嘌呤核苷酸的一个磷酸。 ②由鸟苷酸转移酶催化加上一个倒转的一磷酸鸟苷酸，产生一个特殊的5′,5′—磷酸二酯键。 ③由（鸟嘌呤—7）甲基转移酶催化，在G7位甲基化，产生O型帽子（Cap—0，m7GpppXpYp）,已知酵母中以O型帽子为主。 ④I型帽子：更高等的真核生物中，将进一步甲基化形成更复杂的帽子，包括在（核苷—2′）甲基转移酶催化下，在转录物中第一个残基（+1）和核糖O 位置加上甲基，产生I型帽子（Cap—0，m7GpppXpYp）。

II型帽子：如果这个位置是腺嘌呤，N 位的碱基也可能被甲基化。在有些物种中，+2位的核苷也被甲基化，产生II型帽子（Cap—2，m7GpppXmpYmp）。 （2）RNA3′端的多聚腺苷化： ①定义：真核生物成熟mRNA的3′端带有200—250个腺苷酸残基，称为多腺苷酸尾巴，具有此特征的mRNA表示为poly(A) ，不具有此特征的mRNA表示为poly(A) 。poly(A)尾巴不是由DNA编码，而是转录后在RNA末端腺苷酸转移酶的催化下，以ATP为底物添加到mRNA的3′端。在hnRNA的3′端拖尾序列中存在6个核苷酸（AAUAAA）的高度保守的加尾识别序列，或多腺苷酸化位点。 ②意义:A.参与新生RNA从DNA/RNA/RNA聚合酶II三联体复合物中的释放。B.与转录欧联既能促进转录终止，也能防止mRNA“早熟”。C.参与前提的3′端内含子的除去。D.稳定mRNA。E.影响翻译效率。 （3）RNA的剪接： ①I型内含子的结构与剪接：其内含子的特点是：A.前体RNA中内含子边界序列为5′U—G3′。B.内含子序列中含有多对内部核心序列CCS，它们两两成对反向平行，序列互补，可以形成分子内双链二级结构，以保证长的内含子能有序的折叠。C.在靠近的内含子的5′边序内，存在一段与5′供点、3′受点序列发生互补，形成二级结构的“内部引导序列”IGS，利用IGS将供点U与受点G靠近以进行剪接。 ②II型内含子的结构与剪接：内含子的结构特点是：A.边界序列为供点GUGCG......受点AU，符合Chambon Rule(即GT—AG法则)。B.在靠近内含子3′端受点上游有序列为Py Pu Py Py U A Py的7nt分支位点，在这7个核苷酸的序列中A为完全保守的碱基。 ③III型内含子结构与剪接：这种内含子的剪接主要发生在核内的前体mRNA，其边界序列的结构与II型内含子极为相似，具有供点GU......受点AG的序列结构和Py X Py U A Py7核苷酸的分支位点，其中A为转酯攻击位点，但与II型内含子的区别在于：内含子内部序列不能形成有序的二级折叠，必须由snRNA逐级组装成剪接过程。 ④反式剪接：在这种剪接方式中，被剪接的外显子来源于不同的基因，甚至不同的染色体。 ⑤选择性剪接：对内含子以及外显子进行选择性地剪接称为选择性剪接。 （4）RNA分子内的其他修饰：甲基化、脱氨、硫取代等多种修饰反应。

（5）RNA编辑：

RNA编辑有如下几种机制：一是碱基替换编辑，编辑复合体识别二级结构中某些特殊的区域，或者直接识别一段特殊的序列。一般是编辑位点周围较短的序列可以使酶识别靶位点。二是碱基插入编辑，锥虫coxIII基因的mRNA中一般以上的U在DNA中没有被编模板的插入编辑，即RNA编辑所需要的信息或者来自向导RNA，或者mRNA自身。

第五章蛋白质的翻译

5.1蛋白质合成的装备

1.合成蛋白质装置的基本组分有信使RNA（mRNA），由几种核糖体RNA(tRNA)和多种蛋白质构成的核糖体和转运RNA(tRNA)。 2.mRNA的结构和功能：

（1）结构：所有信使RNA都具有两个必须特征—一段可翻译的密码序列（ORF）和一个核糖体结合位点（RBS）：原核生物的mRNA的第一个密码子AUG上游的一个重要特征是Shine—Dalgarno序列，而真核生物mRNA除第一个密码子AUG的上游是核糖体小亚基扫描AUG的信号序列（CCACC）外，5′端非翻译区上游为帽子结构，3′端非翻译区内有多聚腺苷化的信号AAUAAA以及其校友的多聚A尾巴。

（2）功能：是蛋白质合成的模板。

（3）真核mRNA的合成与成熟都在核内，成熟的mRNA被运往胞质，作为模板翻译蛋白质，其稳定性相对较高，达几个小时。

3.tRNA的结构与功能：

（1）功能：在将密码的信息及排列转换为多肽链中的氨基酸序列的过程中起着中心及桥梁的作用。这种桥梁作用既是实体的，也是信息的，因为它们能把mRNA和多肽结合在一起，并保证多肽链的合成是按照所提供的氨基酸的顺序进行的。tRNA的这种双重功能与它的结构是统一的。 （2）结构： ①分子的5′端和3′端的7个碱基对形成氨基酸承受臂。哎计算被链接到tRNA的3′端的一个高度保守的CCA序列的腺苷酸残基的3′—OH上。 ②DHU环：即环中含有修饰碱基—二氢尿嘧啶。直接与氨基酰tRNA合成酶结合。 ③反密码子环：含有能在翻译期间与mRNA三联体密码子进行碱基配对的反密码子（第34，第35，第36位核苷酸），担负识度密码的功能。其中第34位的核苷酸表现为对密码子中的第3位核苷酸的摇摆选择配对，也称为摇摆位点。 ④额外环或可变环含有3—5个核苷酸（I类tRNA）或13—21个核苷酸（II类tRNA），用于tRNA分类。 ⑤TΨC环：该环的命名是因为环中始终含有胸腺嘧啶—假尿嘧啶—胞嘧啶的序列。其功能主要表现为与构成核糖体大亚基的5SrRNA结合，稳定蛋白质翻译装置。

5.3蛋白质的翻译

1.蛋白质翻译的若干基本概念：

（1）多顺反子:j即参与一个代谢途径的若干结构基因编码在同一个转录单位内，具有多个开放阅读框，多顺反子是原核生物操纵子的主要结构形式。

（2）阅读框：解读mRNA中遗传密码的三联体方式。

（3）开放阅读框：按一定的阅读框，从起始密码到终止密码可连续解读遗传密码的区域。 （4）反密码子：tRNA反密码子环上能与mRNA密码子互补配对的三核苷酸序列。

（5）氨酰tRNA合成酶：催化特定的氨基酸准确负载与其对应的tRNA上的专化性酶类。因此AARS具有双重重要的功能，即结合特定的氨基酸与识别对应的tRNA。

（6）起始氨基酸：蛋白质合成开始的第1个氨基酸。

（7）核糖体结合位点：位于mRNA5′端，被核糖体识别并结合的较为保守的核苷酸序列。在原核生物中该位点称为SD序列，位于起始密码上游3—10bp的位置，其保守序列为5′—AGGAGGU—3′。 2.tRNA对氨基酸的专一性负载

第六章基因表达的调控

1.基因表达：是指贮存在DNA序列中的遗传信息经过一系列步骤表现出其生物学功能的整个生物学过程。

2.管家基因：那些维持细胞的基本代谢过程所必需的、在不同的细胞类型和细胞生长时期组成型表达的基因称为管家基因。 3.奢侈基因：而为细胞分化、生物的发育以及生物适应环境所需要的基因则称之为奢侈基因，这类基因的表达表现出明显的时空调控特性。

6.1原核生物基因表达调控的理论与模式

1.乳糖操纵子的负调控诱导模型:

乳糖操纵子时典型的负调控诱导型方式。乳糖操纵子的调节基因中I基因编码一种相对分子质量为38000的多肽单体分子，4个单体分子聚合形成一个四聚体蛋白质这种四聚体蛋白质可作物阻遏物与DNA链上的操纵基因（O）序列结合，阻断了依赖DNA的RNA聚合酶与启动子序列的识别和结合，导致乳糖操纵子不能被转录。在乳糖操纵子中，阻遏蛋白是一种变构蛋白，当某种物质与之结合后就会改变蛋白会构想，使之与O基因结合的亲合力下降。而与阻遏蛋白结合的物质为异构乳糖，也称为乳糖操纵子开启诱导物。一旦它与阻遏蛋白结合，就导致构象发生改变的阻遏蛋白从操纵基因序列上解离，或使游离的阻遏蛋白的构象发生改变而不能与O基因结合。在不存在乳糖，或者乳糖与葡萄糖并存时，乳糖操纵子就一直处于关闭状态，当葡萄糖被用完，为乳糖又存在时，细菌就可开启乳糖操纵子，合成分解乳糖的相关酶，实现对环境适应的表达调控。 2.乳糖操纵子突变类型的遗传分析

（1）O基因发生突变：阻遏蛋白必须与O基因上一段特异性地DNA序列结合才能发挥作用。当O基因发生突变，使得阻遏蛋白与突变的DNA序列的结合力下降，使乳糖操纵子总是处于开放状态。表现一种组成型突变。 （2）调控基因（I）发生突变：突变型可分为两种： ①I基因发生在阻遏蛋白的DNA结合位点上，突变基因的表达产物失去与O基因的结合能力，无论乳糖是否存在，乳糖操纵子总是处于开放状态。I基因的这类突变称为组成型突变，记作I 。 ②如果I基因的突变发生在阻遏蛋白与效应物的结合位点，则突变基因的表达产物不能与效应物结合，即使存在效应物，效应物也无法与阻遏蛋白结合，不能改变阻遏蛋白的构想，被结合在O位点上的阻遏蛋白也不能被解离下来。因此，无论有无效应物，乳糖操纵子都处于关闭状态，I基因的这类突变为超阻型变异，记作I 。

（3）正常调节基因合成的阻遏蛋白能掩盖突变阻遏蛋白基因的作用，关闭乳糖代谢基因的表达；而正常操纵基因序列不能恢复突变操纵基因（ ）所控制的乳糖代谢基因的表达。因此阻遏蛋白基因突变 对正常阻遏蛋白基因 而言，表现为隐性，突变的操纵基因 对正常操纵基因 而言，表现为显性。

（4）阻遏蛋白基因突变与乳糖代谢基因其紧密连锁子对不论顺式还是反式位置关系，都是隐性的，而操纵基因突变与乳糖代谢基因在反式时是隐性的，在顺式时是显性的，所以这种显性关系也称为顺式显性，即顺式作用因子 的对与其紧密连锁基因的控制效应不受其等位基因的影响，而表现出的显性效应。

（5）阻遏蛋白基因与乳糖代谢基因是相互独立的，对细菌的乳糖代谢这一功能而言，它们不是一个作用整体。与此相反，操纵基因与乳糖代谢基因是一个作用整体，不能分割。确定位置关系时，我们利用了二倍体。实际上，细菌只有一个染色体，因此，阻遏蛋白基因与乳糖代谢基因不是一个作用整体应理解为一条DNA上两个独立发挥作用的部分；在空间上，他们可以很接近，也可以相距很远。 3.色氨酸合成酶操纵子

（1）色氨酸合成酶操纵子结构：大肠杆菌色氨酸的生物合成需要5种酶催化5步反应来完成。编码这5种酶的基因分别为紧密连锁的5个基因trpE、trpD、trpC、trpB和trpA，在基因转录过程中，这5个基因转录到一条多顺反子的mRNA上，翻译后分别编码5种酶。trpE基因是第一个被翻译的基因，与它紧邻的是启动子和操纵子基因。另外，在操纵子基因与结构基因trpE之间存在一个前导区和1个衰减子区，分别为trpL和trpa。色氨酸合成酶操纵子中的调控基因为trpR，远离5个结构基因。

（2）调节机制：trpR基因编码的产物是一种没有活性的阻遏蛋白，在没有色氨酸的情况下，trpR基因产物不能与O基因结合；当色氨酸与trpR基因产物结合后，使蛋白质的构象发生改变，从无活性的阻遏物转变成为具有结合O基因活性的阻遏物。色氨酸自身虽然不是阻遏蛋白，但起到辅助阻遏蛋白发挥功能作用。

（3）大肠杆菌色氨酸合成酶操纵子的负控制模型：当细胞中存在色氨酸是，细胞中将关闭合成酶trpE、trpD、trpC、trpB和trpA的转录，也就是说，细胞中将产生有活性的阻遏物阻抑合成相关的5种酶基因的转录。有些小分子物质与阻遏蛋白结合后可以促进阻遏蛋白与操纵基因的结合，关闭操纵子的表达。当细胞中存在色氨酸时，色氨酸分子就做诶辅阻遏物与trpR基因编码的阻遏蛋白结合，色氨酸与阻遏蛋白形成的复合体进一步与操纵子上的O基因结合，使得RNA聚合酶不能与p基因结合，导致色氨酸合成酶操纵子关闭，trpE、trpD、trpC、trpB和trpA基因不能被转录。然而，当细胞中的色氨酸被豪杰，阻遏蛋白由于没有色氨酸的结合而不再具有与O基因结合的活性，RNA多聚酶便可以与P基因结合，完成5个结构基因的转

录，启动色氨酸合成酶操纵子开放。

6.2不利生长条件下的应急反应

1.严紧反应相关因子：

（1）rRNA和tRNA:在严紧反应过程中，rRNA和tRNA的合成大量减少，这使RNA合成的量仅为应答前的5%—10%；某些mRNA的合成也下降。同时，蛋白质降解速度加快，核苷酸、糖和脂质等的合成量也下降。

（2）魔斑:严紧反应还引起两种一场核苷酸大量增加，即四磷酸鸟苷ppGpp和五磷酸鸟苷pppGpp，这两种化合物是层析谱上检出的斑点，分别称为魔斑I和魔斑II。

（3）空载tRNA:整个严紧反应的触发器是位于核糖体大亚基A位点上的未装载氨基酸的tRNA（空载tRNA）。正常情况下，由EF—Tu将氨基酰—tRNA运转至核糖体A点上。但是当缺乏相应的氨基酰—tRNA时，空载tRNA占据这个空位，核糖体上的蛋白质合成被阻断，引发空转反应。 2.严紧因子反应的调控机制：

（1）当野生型细菌生长在氨基酸完全的培养基上时，由于 基因产生（p）ppGpp合成酶，细菌可以合成正常含量的（p）ppGpp,由于没有空载的tRNA，上述空转反应不能完成，不能刺激合成大量（p）ppGpp，rRNA和tRNA量正常，蛋白可以正常合成。当野生型细菌生长在氨基酸缺乏的培养基上时，细菌 基因虽可以合成正常的（p）ppGpp合成酶，但核糖体A位上的空载tRNA引发的空转反应，进一步刺激（p）ppGpp的活性，大量形成（p）ppGpp，在消耗能量但又不能合成蛋白质的情况下，积累的（p）ppGpp作为阻遏物特异性地与rDNA操纵子的起始位点结合，关闭rDNA操纵子，同时阻止tRNA的转录延伸。当细菌的生存条件回复正常时，细胞中一种名为spoT的基因可编码降解ppGpp的酶，并以约20s的半衰期快速降解ppGpp，从而开放rRNA和tRNA的转录，保证核糖体的重新构建和蛋白质的合成。spoT突变能提高ppGpp的水平，也会使细菌生长缓慢。

（2）当突变型细菌生长在氨基酸正常的培养基上时，由于突变的 基因不能合成正常的（p）ppGpp合成酶，因而细菌中不存在（p）ppGpp，rRNA和tRNA可正常转录，没有空载的tRNA，蛋白质的合成正常，调控系统未出现异常。当将这种突变体培养在氨基酸缺乏的培养基上时，核糖体A位上空载tRNA产生空转反应，但由于没有（p）ppGpp合成酶，不能合成（p）ppGpp，不能调控降低tRNA及rRNA的转录，由于氨基酸的缺乏，蛋白质的合成也不能进行，表现出调控异常的松弛突变型。

6.5转录后水平的调控

1.RNA的干涉

（1）定义：是指短的双链RNA可以降解内源的同源mRNA，而使相应基因表达神魔的一种现象，属转录后的基因沉默。它广泛存在于原核生物和真核生物中，是原核和真核生物中广泛存在的基因表达调控机制。

（2）RNAi的发现与证实：研究者将mex—3基因的反义mRNA和dsRNA注射到C.elegans的卵母细胞中，24h后以mex—3的cDNA为探针检测基因表达的抑制情况。根据结果表明反义RNA对mex—3基因的表达表现了部分抑制，dsRNA对mex—3基因表达具有更为彻底的抑制效应。A.Fire将这种基因沉默现象称为RNA干涉。 （3）RNAi的特征： ①RNAi是转录后水平的基因沉默机制。使用基因外显子区域的dsRNA注入可以明显减少或消除内源的mRNA转录物，而使用与内含子和启动子序列相对应的dsRNA补产生明显的干涉效应。 ②RNAi具有极高的干涉特异性。同源的dsRNA可以引起内源mRNA被特异性地降解为21—26个核苷酸长度大小的片段，从而使生物体表现出该基因对应的沉默表型。 ③RNAi具有极高的干涉效率。极少的dsRNA可引发比对照高达2个数量级的表型，甚至可到达缺失突变体的效应，因而，在RNA干涉过程中可能存在效应分子的扩增机制。 ④dsRNA介导的干涉表现为惊人的细胞穿透力。干涉效应可以转递给其他组织并可转递给后代。dsRNA引发的基因沉默不仅仅局限在其开始的细胞，还可在不同部位的细胞中激发干涉效应，说明存在维持RNAi的特异信号小分子。 （4）RNAi的分子机制： ①生物化学和遗传学的研究表明，RNA干涉可分为起始和效应两个阶段：

起始阶段：加入的小分子RNA或者内源产生的dsRNA被切割为21—23个核苷酸长度的小分子干扰RNA片段。在这一过程中，内源的依赖RNA的RNase参与反应，这种酶称为Dicer酶，该酶为RNaseIII家族中特异识别双链RNA的成员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转座子的转录、病毒感染、反向重复序列的抓路等各种方式引入的双链RNA，将RNA降解为21—23bp的双链siRNA，并且每个片段的5′端被磷酸化、3′端都有两个碱基突出，此结构形式使siRNA进入蛋白复合体所必需的。

效应阶段：siRNA双链首先与一个核酶复合体结合形成RNA诱导的沉默复合物。随后，消耗ATP能量将双链siRNA解链为单链的小分子RNA。siRNA的两条链对形成活性RISC复合物是非对称的，可能由于siRNA链序列的热力学性质所决定，其中一条抑郁进入复合体中，而另一条链则较难。如果与靶mRNA序列一致的单链siRNA进入RISC，是不能激活RISC的；当与靶mRNA互补的siRNA激活的RISC中也存在着另一种不同于Dicer的RNase，并在距离siRNA3′端12个碱基的位置切割mRNA形成25个核苷酸长度的片段。被激活的RISC可以催化多轮剪切反应，使得靶mRNA被完全降解。 ②RNAi分子机制的另一种模型是随机降解的PCR：在线虫和植物中，依赖RNA的RNA聚合酶RdRP对RNAi是必须的。

RdRP以配对的siRNA为引物，以靶RNA位模板，类似PCR扩增形成dsRNA，然后由Dicer切割形成新的siRNA，进入下一步反应。此模型可解释RNAi的高效性和干涉性效应的可扩散性，因为RdRP扩增了siRNA的数量，并且siRNA分子极易穿过细胞，进行远距离的转移。 ③miRNA：它的功能也是参与转录后的基因沉默过程，它们在生物体的生长、发育、分化，凋亡等方面发挥着关键的作用。它与siRNA的区别表现为两个方面：

一是miRNA是内源的，siRNA主要为外源导入的；二是miRNA不仅介导靶RNA的降解，还可与靶RNA通过不完全互补的方式，阻抑蛋白质的翻译。

相同点：它们的形成都需要Dicer,形成复合体中具有相同的蛋白质组成，人工的siRNA在体内能产生类似miRNA的功能，内源的miRNA在与靶RNA完全互补的前提下，也能表现剪切靶RNA的干涉效应，因此，两者可能具有基本相同的作用途径。

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