性控技术现状及未来展望(2)

等 [10]（1984）将大鼠16~32细胞胚胎浸入H-Y抗体中，置于5％CO2箱内37。C下培养6h，发现正常发育和受阻的胚胎各占50％；然后将受阻胚胎取出置于不含H-Y抗体的培养基中孵育数小时后，抑制被解除，胚胎可以继续发育。将未被抑制和解除抑制的两部分胚胎分别移植，后代中前者雌性鼠为77.6％，后者雌性鼠为4.9％。但该方法是以破坏一部分胚胎（雄性）为代价，因此此方法很少使用。

（2）间接免疫荧光法：该法是将胚胎先用H-Y抗血清或单克隆抗体中培养处理30分钟，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的第二抗体处理，在荧光显微镜下观察是否有特异荧光来判断，有荧光者为雄性胚胎，无荧光者为雌性胚胎。White等[22]（1983）用此方法进行研究发现，被标记的鼠胚胎为55.4％，未被标记的胚胎为4.6％；后将这些胚胎分别移植后，雄性胚胎仔鼠为78.3％，雌性胚胎仔鼠为82.6％。1987年，他们发现用此法检测，在牛有89％的雌性鉴定准确率，在猪有86％的雌性鉴别准确率，在绵羊有85％的雌性鉴别准确率。这种方法的优点是不损害胚胎，鉴别的准确率也较高，但对荧光强度的估测则有高度的主观性。此外，胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。

（3）囊胚形成抑制法：该法是利用H-Y抗体对雄性桑葚胚向囊胚发育具有可逆性抑制。Utsumi等1983[10]的原理发展起来的一种胚胎性别鉴定方法。内海恭三（1989）[10]将H-Y抗血清与桑葚胚共同培养一段时间，具有 H-Y 抗原的雄性胚胎则被 H-Y 抗体所抑制，不能形成囊胚腔，而无H-Y抗原的雌性胚胎则不被H-Y抗体所抑制，可在培养过程种继续发育成囊胚，以此可将雄性胚胎与雌性胚胎分开。内海恭三（1989）将大鼠H-Y抗体与大鼠桑葚胚共同培养6小时，形成囊胚者为雌性胚，未形成囊胚者为雄性。雄性胚除去H-Y抗体后培养数小时，还可以形成囊胚。将两种胚胎移植后分别获得了79％（38/48）的雌性鼠和92.3％（21/23）的雄性鼠。似乎这是一种有效的胚胎性别鉴定方法，但其不足之处是容易将一部分的发育迟缓的雄性胚胎误判为雌性胚胎。此外，在实际工作中，如不是通过体外受精，很难同时获得刚好处于桑葚胚期的大量胚胎而不浪费桑葚胚以前及囊胚以后的胚胎。

2.2.4 分子生物学方法

该法的实质就是检测Y染色体上是否存在SRY基因以鉴别鉴别胚胎性别，有SRY基因的为雄性，否则则为雌性。

（1）DNA探针法。该方法的原理是：带有可检测标记(如同位素、生物素或荧光染料等)的一小段已知序列的寡聚核苷酸，长度在十几个、几十个或几百碱基对以上，即一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基

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因，也可以仅仅是基因的一部分。可通过分子杂交探测与其序列互补的基因是否存在。具体操作方法：从胚胎取下少量细胞，将其DNA与Y染色体特异标记的DNA序（探针）杂交，阳性结果为雄性，阴性结果为雌性。Leonard等（1987）首次报道用牛Y染色体特异性DNA多重复序列探针鉴定牛囊胚期胚胎获得成功，他们从胚胎取10~20个细胞作原位杂交，共取150枚胚胎样品，胚胎细胞鉴定准确率为95％。Bondioli等[23]（1989)）用此法进行牛胚胎性别的鉴定，鉴定70例，其准确率为100％ 。探针的标记物有两种，一为放射性同位素，另一为生物素。前者需要大量的胚胎细胞和较长的时间（一般同位素低温暴光需要7~8天），后者技术难度较大，但所需时间较短。使用此方法鉴定准确率达90%以上，但是成本较高、操作繁复、实际应用很少

（2）PCR扩增法。1988年Saili等[10]人建立起来了特异性DNA序列“聚合酶链式”反应（PCR）放大技术。此方法是选用与待放大的DNA片段两个3’—端分别互补的两个寡聚核甘酸引物，在变温和DNA聚合酶催化下进行变性—复性—延伸反应，从而使两引物间规定的那段DNA序列复制，若进行这种反应，该段DNA序列就随着反应周期数的增加而迅速得到多拷贝放大。Heer等[24]（1990）首先采用PCR技术扩增，特异多重序列鉴定了牛羊等家畜胚胎性别，准确率分别为91.6％、96.5％。Gubbay等[10]（1990）发现哺乳动物的性别决定区（Sex—determine region in Y.SRY）位于染色体短臂A区的35Kb的序列内，是一个长约250bp，可编码80多个保守氨基酸的单拷贝基因，用PCR技术来检测SRY的有无，便可以判别胚胎的性别，从而为胚胎性别提供了可靠的保证。曾益滔等[25]（1991）应用DNA直接测序法测定了牛SRY，基因的“核心序列”，在此基础上设计合成了两对牛SRY，序列特异的PCR扩增引物，建立了超微量扩增单拷贝SRY基因技术方法，并用此方法鉴定了17枚牛胚胎的性别，其中雌性7枚，雄性10枚；后用于移植，结果有4枚移植成功，犊牛的性别与鉴定结果一致，准确率为100％。罗应荣（1991）[10]用PCR进行绵羊和牛胚胎的性别鉴定，准确率分别为80％（20/25）和82％。Utsumi（1991）使用PCR技术对牛的全胚、半胚和部分胚胎细胞进行性别鉴定，准确率分别为100（45/45）、100％（19/19）和92％（(12/13）。目前，PCR进行胚胎性别鉴定的最大问题是污染问题（Herr等，1990）[24]，在采摘胚胎细胞时间如采到粘在胚胎上的精子、空气中的污染、PCR试剂的污染，以及培养液中的BSA、FCS都可能成为污染源，引起阳性结果。

（3）FISH 荧光原位杂交。基本原理是：如果被检测的染色体上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测

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体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。该法的优点：1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。缺点是：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降，荧光素分辨率低且对胚胎毒性较大。

（4）LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)环介导等温扩增反应。鉴于PCR方法操作较复杂，对仪器和操作人员要求较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广受到限制。2000 年，日本学者Notomi 等［26］在Nucleic Acids Res 杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即环介导等温扩增反应。LAMP 法是一种全新的基因扩增法。由于双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一条引物对双链DNA的互补部位进行碱基配对时，一条链就会脱落变成单链。在等温条件（60-65℃）下孵化，通过测定扩增基因时出现的副产物-焦磷酸镁的混浊度来判断是否存在目标基因。反应时间

［27］

40min左右。PCR 法相比，具有以下特征：①不需要使双链DNA先变性成单链；

②扩增反应在等温下可持续进行；③扩增的效率极高；④针对6 个区段使用4 种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列；⑤仅使用1 种链置换型DNA 聚合酶，成本低；⑥扩增产物是以同一条DNA 为模板形成大小不一的结构；⑦当模板是RNA 时，仅需加入逆转录酶即可与DNA 一样进行扩增［28］。

3 性控技术未来展望

奶牛是单胎动物。其自然繁殖率低。目前，采用常规的人工授精繁育技术，远不能满足产业化发展的需要。我国良种奶牛繁育及精液供应市场还处于培育阶段。参与人工授精奶牛头数仅占可繁殖母牛的40%，情期受胎率为70%，母犊出生率为50%左右。由于奶牛自然繁殖率低，繁殖速度慢，使得国内现有奶牛种群扩繁受到很大限制，从国外大批引进种奶牛要花费大量的外汇，也受到隔离场数量不足和进口国牛源及牛品质的限制。因此，成为目前我国奶业发展的瓶颈。调整奶牛品种和品质结构，提高个体单产，关键是要加快推广应用一批优良品种和先进生产技术，积极引进国外优良品种和先进技术，加快优质、专用品种的选育和推广。而性别控制技术，即XY分离精液的优势恰恰克服了我国高产纯种奶牛缺乏

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这一缺陷。XY精子分离技术是当今获得良种母牛后代的最先进、最快的一种良种繁育技术，它可以最大限度地发挥良种牛的繁殖潜力，加快奶牛品种结构调整，提高良种牛繁育速度。经过十几年的研发，XY精子的性控比率已达到93％以上，XY精子的受精成活率已达65％，这意味着如果得到1头良种母牛犊，采用传统的冻精技术，则需要5剂精液，花费2年的时间，而采用XY精子分离技术，只需要2.5剂精液，花费1年的时间。不论从繁育的成本还是从生产效率方面考虑， XY精子分离技术都将是畜牧业的一场技术革命。与此同时，随着生物科学技术的发展，将SRY基因上的片段进行有效的整合将来也将成为可能。性控技术和其产品—性控精液应用于奶牛业，将最大限度地发挥良种牛的遗传、繁殖潜力，增加遗传和表型性别的选择强度，加快遗传进展，从而加快牛品种结构调整，提高生产效率和良种牛繁育速度。同时可显著提高奶牛的生产水平和奶农收入，大大促进中国乳业的发展。

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参 考 文 献

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