性控技术现状及未来展望

家畜性别控制技术现状及未来展望

家畜性别控制（Sex Control）技术是指通过人为干预，使雌性繁殖动物按人们的愿望繁衍所需性别后代的技术。性控技术是基于对性别决定和分化机制认识基础上的应用。家畜的性别控制在生产实践中具有广泛的现实意义。主要有：（1）发挥性别控制性状的潜能。 通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状（如泌乳）和受性别影响的生产性状（如生长速度、肉质等）的最大经济效益。（2）排除伴性有害基因的危害。消灭不理想的隐性性状，防止性连锁疾病的发生。如血友病，色盲，杜兴氏肌肉营养不良等（3）加速遗传进展和畜群更新。控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。（4）加快珍稀频危动物的繁殖进程。（5）克服母牛异性孪生不育等

1 家畜性别控制的历史回顾

早在公元前400多年，Democritus就设想人为地控制动物性别。在我国民间有许多人为控制性别的说法。进入20世纪后，随着科学技术的发展，关于人为控制动物性别逐渐发展成为一门科学。1902年，Mcclung在研究蝗虫精细胞时，在历史上第一次提出性别决定的染色体理论。Stenvens和Wilson研究指出，雌、雄个体中不同的性染色体与性别有关，并将性染色体定义为X染色体和Y染色体。20世纪前半个世纪的大量研究证实，哺乳动物的性别是由一对性染色体所决定的。在哺乳动物的所有正常配子中均含有一组常染色体和一条性染色体，即雌性卵子所含的性染色体为X染色体，而雄性精子则有两类性染色体，一部分精子含有X染色体，另一部分则含有Y染色体。携带Y染色体的精子（Y精子）与卵子结合受精，其受精卵就向雄性个体（XY）发育，而携带X染色体的精子（X精子）与卵子结合受精，其受精卵就朝雌性个体（XX）发育[1]

1955年Eichwald和Silmser[2]发现了雄性特异性弱组织相容性抗原（H-Y），引发了对精子分离选择和胚胎性别鉴定的广泛研究。1959年，Jacabs[1]等认为决定雄性性别的因素存在于Y染色体上，并于1966年证实雄性性别决定基因位于Y染色体短臂上。20世纪80年代，美国韦赫生物医学研究院发现，Y染色体上的基因启动雄性性别的发育，将该基因称为睾丸决定子（Testis-determining factor TDF[3]。Palmer 等（1989）[4]发现，决定动物性别的基因是Y染色体上一个核心区基因，并将其命名为SRY（Sex Determining Region in Y-Chromosome）。由于

一系列的动物性别决定因素的发现，人们针对性地研究出许多进行性别鉴定的有效方法，为动物性别控制开辟了行之有效的科学方法。

2 性别控制的基本方法

目前，性别控制的方法可分为两大类：一为X与Y精子的分离，二为鉴定胚胎性别。

2.1 X与Y精子的分离

2.1.1 分离X与Y精子的生物学基础

（1）X精子的F小体：1968年Cosperson[5]在研究男性染色体时发现，在Y染色体长臂末端发出有比其他部分强的荧光亮点，将这些点称为F小体。1970年Barlow[6]等首次报道在Y精子头部发现F小体，且F小体在人和家畜的精子上都能见到。后来经实验反复证明，有F小体的精子一定是Y精子，而没有的则是X精子。

（2）精子的重量：X与Y精子在重量和比重上有差异，主要表现在DNA量的不同。Morruzi(1979)[7]报道了X与Y精子染色体所含DNA的不同，X染色体更大，其DNA含量也比Y染色体所含的DNA多，重量更大。两者的DNA含量差异一般在3％~5％之间，其中牛为3.9％，绒鼠为7.5％（Johnson等，1987b）[8]。由于重量和比重的不同，而致X和Y精子在液体中运动力、沉降速度等的不同。

（3）精子运动：据报道，Y精子的活动能力比X精子强，运动速度快，在含血清蛋白的稀释液中呈直线运动。Ericsson[9]等（1973）将人的精液置于血清白蛋白柱的上层，从柱的最下面分离出的精子与原精液相比，运动的精子的比率高，其83％为F小体阳性，即Y精子。精子的表面膜电荷：精子的表面均带有膜电荷，为负电荷，但X、Y精子表面的电荷量和分布有差异。膜电荷量取决于同核蛋白结合的唾液酸的含量。Y精子尾部膜电荷较多，而X精子头部膜电荷较多。

（4）精子的耐酸碱性：Y精子更嗜碱性，而X精子则更嗜酸性。 （5）H-Y抗原及分布：H-Y抗原即雄性特异性弱组织相容性抗原（Male Specific Minor Histocompatibility—Y Antigen，简称H-Y抗原），H-Y抗原是一种弱抗原，并且已证实，只有Y精子才能表达H-Y抗原。 2.1.2 精子分离的研究方法和现状

由于X、Y精子存在物理化学和生物学上的差异，人们一直试图依据这些微小的差异将X、Y精子分离。

（1）沉降法：Schilling等（1967）[9]将由脱脂乳、盐类及卵黄组成的液体，

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调制成黏度为7~10CP、比重1.037~1.044的液体，用于沉降分离牛精子。沉降时间在60min内，使用最下层的分离液对母牛进行人工受精，结果雌性率为70％。用上层部分精子配种，雄性犊牛为63.9％。实验在牛、羊等上的多数结果表明：用上层精液输精得到的多数为雌性，而下层则多数为雄性，但是各种结果的差异性很大。沉降法虽然有一定的效果，但试验结果不稳定。

（2）离心沉降法：Lindahl(1970)[10]在12~20摄氏度环境下离心牛精子，将上下层精子分别给母牛输精，上层产公犊58.7％（27/46），下层产母犊58.72％。Shastry等[11](1977）用聚蔗糖胶体密度梯度分离出73％ 的含F小体的精子。Luderer等（1982）[12]用牛顿凝胶离心分离牛精子输精，得雄性犊牛29头，雌性犊牛25头。乌兰少布（1985）用生理盐水稀释羊精液并离心，输下层液雌羔率为76％，上层液为21.87％。玲木达行（1986）[10]用Perool密度梯度分离牛精子，将分出的X精子层给母牛授精所得母犊77.8％。Ogawa等（1987）[10]用密度梯度离心法分离猪精子，在底层收集到的精子中，有F小体的精子为10.1％。虽然离心沉降法分离精子的成功率较高，但离心过程对精子破坏性大，常使精子畸形、活力下降。

（3）电泳法：Shoredon(1932）[13]用电泳法分离牛精子，分别收集向两极运动的精子。阳极雌性占71.3％，阴极雄性占63.8％。Hafs和bod(1974[12]将10％卵黄磷酸缓冲液稀释的精液3.5ml置于活动式间隔槽内，以8V/cm和21/cm在35摄氏度下电泳移动1min，用正极处的精子输精得到121头犊牛，55％为雄性；用负极处的精子输精得到137头犊牛，44％为雄性，但对照组的59头犊牛中也是44％为雄性。Cardon（1975）[13]电泳兔精液，用阳极精液输精，仔兔中有74.3％为雌性；阴极精液输精，雌性率仅占15.1％。刘嗣枢等（1985）[13]用改装电泳装置分离牛的精子，阳极侧X精子占90.38％。Mobri等（1986）[10]用自由电泳法处理人的精液时发现，在pH7.4时，阳极侧多为X精子，阴极侧多为Y精子（80％）；Engelmannl等[10]（1988）用此方法却得到与此完全相反的结果。

（4）免疫学分离法：该方法是利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，以此来分离X精子和Y精子。由于H-Y抗原极弱，因此对细胞表面H-Y抗原进行血清学和免疫学的检测在70年代的效果并不理想。随着生产高效价H-Y抗体方法的发展，并在Bryant等[12]（1980）应用H-Y抗体免疫学亲和柱层析首次成功地分离了人和小鼠的H-Y阳性和阴性精子后（已经获美国专利），利用H-Y抗原进行动物性别的控制的研究才有实质性进展。Zavos（1982）[14]用兔子生产抗血清进行实验，把H-Y抗血清注入母兔阴道，15min后输精，产出的雌性兔为74.2％；1987年他又采用免疫过滤法对兔子和牛进行试验，用抗H-Y的单克隆抗体晕聚精细胞的H-Y

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复合体，结果后代中雌兔为78.9％、母犊为74.4％。Bradley（1989）[12]用免疫亲和柱层析法分离绵羊的H-Y阳性和H-Y阴性精子，发现未结合到层析柱的精子有70％~80％为阴性，结合到层析柱上而后被洗脱下来的精子75％~78％为阳性；而对照组的H-Y阳性和H-Y阴性精子分别为43％~44％和56％~57％。王光亚等（1994）

[15]

用兔H-Y抗血清进行试验，将效价为1：32的兔H-Y抗血清输入发情母兔阴道内

10~15min后自然交配，所生2只小兔均为雌兔。

（5）流式细胞分离法（流式细胞光度法）：借助流式细胞光度计进行测定，其理论依据是X与Y精子DNA的含量不同。DNA含量高，当用专用荧光染料染色时，其吸收的染料就多，发出的荧光也强，反之发出的荧光就弱。这种分离方法开创了精子分离的新局面。Johson等[16]（1989）用分离的兔Y精子在子宫内输精后，预测雄性兔比例为81％，实际亦为81％；X精子输精后预测雄兔的比例为14％，实际产雄兔的比例为6％。1991年他用经使用该法分离的猪X精子输精后，获得74％的雌性仔猪，Y精子输精后获得68％的雄性仔猪。Gran等[17]（1993）使用该法分离牛精子用于体外授精，将胚胎移植给9头受体牛，其中4头妊娠产牛犊6头，3头雌性，3头雄性，均与预测性别相符。Abeydeera等[18]（1998）报道，利用该法分离的猪X精子授精，产雌性23头，雄性1头，准确率为97％；利用分离的Y精子授精，产雄性仔猪率为100％。Seidel等[19]（1999）报道了使用牛分离精子冷冻保存后的授精效果，后代性别准确率在90％以上。但是用一般流式细胞分类器分离精子时，需要精子一个个通过，这样就必须稀释精液，造成精子的运动能力下降，加之分离效率太低，目前还无法应用于实际生产。但是，据Johson（2000）

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报道，同时分离收集X和Y精子，分离速度以达到每小时6000000精子；若只分

离和收集X精子，则分离速度可达到每小时18000000精子，看来，用于生产实践为期已不远。如果结合显微注射技术，该方法将是一种有效的分离X、Y精子的技术。

其他方法：柱层析分离法、化学药品处理法、Y特异性DNA探针法。在奶牛上人们研究了输精时间与后代性别比例关系，发现排卵前输精易得雌性后代，排卵后输精易得雄性。

2.2 胚胎性别鉴定

动物性别控制可以通过对其胚胎进行性别鉴定，然后移植所需要的性别，以达到性别控制的目的。至今发展较为成熟的方法包括：细胞学方法、生物化学微量分析法、免疫学方法和分子生物学方法。 2.2.1 细胞学方法

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该方法是经典的胚胎性别鉴定方法，主要是通过核型分析而对胚胎进行性别鉴定。鉴别过程是将胚胎用含有丝分裂阻滞剂的培养液培养，然后诱使细胞肿胀及染色体扩展并加以固定、染色、在显微镜下检查其核型，其准确率为100％。但要获得高质量的中期染色体分散相难度很大，据报道中期分散相的获得率一般在61％~81％之间，而能用于进行核型鉴定的只有6.7％~60％。这对于胚胎的浪费很大，而且耗时费功。虽然结合了胚胎分割技术，分割一半胚胎用于鉴定，另一半进行冷冻或者移植，已经获得性别鉴定的犊牛（Seike）[10]。目前该方法主要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。 2.2.2 生物化学分析法

该方法是通过测定与X染色体相关的酶活性，来达到鉴别胚胎性别的目的。其原理是早期雌性胚胎的两条X染色体中有一条失活。一般在哺乳动物中雌性带有两条X染色体，而雄性则带有一条X染色体和一条Y染色体。在胚胎发育早期，为保持两性间的基因等量，雌性的一条X染色体失活。在胚胎基因组的激活和X染色本失活这一短暂期雌性胚胎的两条X染色体都可以被转录和翻译。这样雌性胚胎的X染色体连锁酶的活性和浓度是雄性胚胎的两倍。这些相关酶有6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)。这最终反映在雌性胚胎中与X染色体相关酶的细胞内浓度及活性是雄性胚胎的两倍，这就是该法进行性别鉴定的理论依据。WWilliam对桑葚胚、囊胚阶段的胚胎进行了X染色体相关酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）活性检查，对雌性胚胎鉴定的准确率为93.94％（62/66）。Monk等[10]（1988）用8细胞鼠胚的一个卵裂球检查了X染色体相关的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）活性，雌性和雄性细胞鉴定准确率分别为91％和100％。但是，由于X染色体失活的确切时间还不知道，如果有些雌性胚胎的X染色体提前失活，就很容易将雌性误判为雄性。 2.2.3 免疫学方法

是指利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行的胚胎鉴别方法。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法，即：细胞毒性分析法、间接免疫荧光法、囊胚现成抑制法。

（1）细胞毒性分析法：该法是将H-Y抗血清与补体（鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养中继续发育的胚胎判为H-Y阴性（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚者判为H-Y阳性（雄性）。Shelton（1981）把经细胞毒性处理而没有溶解的鼠胚进行移植，得到81％ 的雌性个体。White 等（1982）[21]在体外处理鼠8~16细胞胚1000枚，其中479枚（48％）为雄性。他将未发生反应的胚胎进行移植，所得58个仔鼠中50个为雌性（88％）。Kyozo Ustsumi

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