[gbk] 鲍曼不动杆菌检测分析手册[1](2)

对鲍曼不动杆菌的长期保存可采用冻存的方法，保存液配方见附录，也可用冻干方法。短期保存可采用灭菌滤纸或保存液-20℃保存。

七、 培养基和培养条件

鲍曼不动杆菌为专性需氧菌，营养要求不高，普通培养基上生长良好，最适生长温度35℃，可在麦康凯培养基上生长。

常用培养基有血平皿、营养琼脂、伊红美兰琼脂平板、MH琼脂等，液体培养基常用营养肉汤、MH肉汤等。具体培养基配方见附录。

八、 形态学特征

鲍曼不动杆菌为革兰氏阴性菌，球杆状，无芽孢、无鞭毛，单个细胞大小为（1～1.5μm）×（1.5～2.5μm），有时很难脱色，通常成对排列。在静止生长和非选择性琼脂，以球杆状形态为主，而在液体培养基中的早期培养物和在含抗细胞壁的抗生素平板上的培养物，多为杆状（见图８－１）。菌落光滑，不透明，比肠杆菌科成员的菌落略小一些，菌落为无色或略带粉色。

图８－１ 鲍曼不动杆菌革兰氏染色图片

九、 生物化学鉴定

1．API 20 NE（BioMérieux，REF20050）——非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统，包括8个标准化测试和12个同化试验。见表9-1。但由于鲍曼不动杆菌与醋酸钙不动杆菌同属于Acb复合体（A. calcoaceticus-A. baumannii complex），仅从生化表型难以区分，所以鉴定结果均为A. baumannii/ A. calcoaceticus。而且该试条只覆盖了不动杆菌属中7种已命名的不动杆菌（A. baumannii/A. calcoaceticus, A. haemolyticus, A. junii/A. johnsonii, A. lwoffii, A. radioresistens），如果要准确鉴定到鲍曼不动杆菌，或不动杆菌属除以上7种已命名的不动杆菌之外的其他种还需要进一步的分子生物学试验。

图9.1-1 API 20 NE鉴定系统（鲍曼不动杆菌）

表9.1-2 API 20 NE质量控制菌株试验结果

NO3 TRP GLU ADH URE ESC GEL PNPG GLU ARA MINE MAN NAG MAL GNT CAP ADI MLT CIT PAC OX 1 + + + + - + + 2 + - - V V - + 3 - - - - - - - 4 - - - - + + - + - - + + + + - - - + + + - - + + + + + + - + -* - + + + - + + + + + - + - - - - + - + + + + - + + - - - - - - + 附注：* 可能只产生微弱反应

标准菌株如下：

1－Aeromonas hydrophilia (嗜水气单胞菌)ATCC35654 2－Pseudomonas aeruginosa (绿脓假单胞菌)ATCC27853 3－Alcaligenes faecalis (粪产碱菌)ATCC35659

4－Sphingobacterium multivorum (多食鞘氨醇杆菌)ATCC35656

2．触酶（catalase）试验：按无菌操作技术，将细菌涂抹至载玻片上，加１～２滴３％过氧化氢水溶液，若迅速冒出气泡，则为阳性反应，表示细菌含有可将过氧化氢分解为氧气和水的触酶。

十、血清学鉴定

无

十一、毒力基因检测

鲍曼不动杆菌被认为是较低级的病原菌，对于其毒力因子的研究目前还处于初级阶段，有报道用PCR的方法检测了目前大肠杆菌（Uropathogenic E. coli）已知的17个已知的毒力因子基因，但均为阴性 (5) 。相信随着近期鲍曼不动杆菌全基因组测序工作的完成，毒力因子的确立与检测工作会得到进一步的发展。

十二、生物分型

无

十三、分子分型

1． PFGE

脉冲场凝胶电泳（PFGE）是目前鲍曼不动杆菌菌株分型中较成熟、较常见的分型方法，常用于确定疫情的暴发以及传染源。

2． MLST

多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）不仅可以应用于分子流行病学研究，还可以用来研究微生物的遗传种群结构（population genetic structure）。鲍曼不动杆菌的MLST方法是通过扩增7个管家基因的内部片断，进行序列比对，并通过不同等位基因的排列组合来确定基因型。 （2）等位基因的比对

由于等位基因的鉴定是通过7个管家基因内部片断的序列比对来进行，所以扩增产物经测序后得到的序列必须经过剪切才能在数据库中进行比对。由于单碱基变异也能产生新的等位基因，所以基因序列必须通过双向测序获得，并保证100％正确。

剪切后的7个管家基因序列可以单独或同时进行网上数据库比对，如果序列对应于数据库的已知等位基因，将会得到相应的等位基因号（allele number），如果鉴定为新的等位基因，需进一步与最相近的等位基因进行人工比对，确认差异是否确实存在。经确认后，把测序彩图提交给数据库管理员（karen.mcgregor@tvu.ac.uk），验证后将会得到新的等位基因号。

任何与搜库菌株具有相同或相近等位基因谱（allele profile）的菌株信息可直接点击搜库结果中的菌株名而获得。

当菌株数量较多时，也可用batch query 菜单同时输入多个菌株的数据来进行搜库。

3． MLVA

由于鲍曼不动杆菌的全基因组测序工作刚刚完成，还没有开展MLVA方面的工作。

4． 其他分型方法

（1） 质粒指纹图谱：主要利用碱裂解法、商用试剂盒等提取质粒的方法提取质粒，电泳比较菌株质粒构成谱。缺点为还没有标准化，不同的提取方法或试剂盒可能部分菌株的部分质粒丢失等。

（2） 外膜蛋白谱：提取外膜蛋白后通过SDS-PAGE电泳对不同菌株进行比较，缺点为不同培养条件不同实验室的数据间难以比较。

（3） 随机引物扩增：

十四、鉴定程序和标准

1．鉴定程序

不动杆菌的鉴定程序见下列流程图

37℃ 18～24h

尿液、痰液、脓液、血液、脑脊液 直接涂片 革兰染色 镜检

分离培养（血平板） 可疑菌落 ARDRA 最后报告

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