表观遗传学导论（提纲）(2)

蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase）作用在同一位置加合上甲基，则会形成一个异染色质蛋白HI（heterochromatin protein 1, HP1）或其他抑制性染色质因子的结合位点。HP1的结合转而会导致DNA分子上特定CpG岛的甲基化和稳定的基因沉默。真核细胞中,存在着一个由DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质结构重塑和ncRNA系统组成的一个表观遗传修饰网络，能动地调控着具有组织和细胞特异性的基因表达模式。机体的表观遗传模式的变化在整个发育过程中是高度有序的，也是严格受控的。

二、基因组印迹

基因组印迹(genomic imprinting)是指亲代来源依赖性基因表达。除性染色体上的基因外，子代从亲代获得全部双拷贝基因，但是不是所有的基因都表达。有些基因仅来源于父系或母系一方的单等位基因表达，而来源于另一方的等位基因失活。这种亲代来源依赖性单等位基因表达现象称为基因组印迹。印迹基因是否表达取决于其在上一代是位于雄性还是雌性细胞染色体上。基因组印迹不遵循孟德尔遗传规律，是一种非遗传性基因调控方式。 基因印迹的异常往往会导致多种遗传性疾病。1956年A.Prader 和H.Willi 等医师报道了一种因父源染色体15q11-13区段缺失而引起的儿童早期发育畸型，患儿特征是肥胖，矮小，并伴有中度智力低下，称为Prader-Willi 综合征(Prader-Willi Syndrome, PWS)。1968 年H.Angelman医师报道因母源染色体同一区段缺失引起的一种在儿童期以共济失调，智力严重低下和失语等为特征的综合征，称为Angelman综合征(Angelman Syndrome，AS)。PWS 和AS这一对综合征表明父亲和母亲的基因组在个体发育中有着不同的影响，不同亲本来源的等位基因缺失会引起不同的表型改变。Beckwith-Wiedemann综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome，BWS) 是一种过度生长综合征，常伴有肥胖和先天性脐疝等症状，并有儿童期肿瘤易患倾向,它是由于染色体11p15.5区段的表观遗传机制异常导致基因印迹丢失所引起。 基因组印迹的形成是配子或合子中的某些基因经过表观修饰（epigenetic modification），造成后代体细胞中两个亲本等位基因中一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持单等位基因活性（monoallelic activity）的等位基因差异性表达现象。目前的研究表明，差异性甲基化修饰是产生基因组印迹的主要表观修饰机制。在PWS和AS患者缺失的15q11-13微小染色体区段分析发现，这一区域有成簇排列的、富含CpG岛的基因表达调控元件，称为印迹中心（imprinting centers , ICs）。在父源和母源染色体上，这些调控元件的CpG岛呈现甲基化型的明显差异，在遗传自母源的染色体上的CpG二联核苷完全被甲基化，而遗传自父源的染色体的CpG二联核苷则全都为非甲基化。即父源和母源染色体上的ICs的甲基化呈现出分化状态，或者叫差异甲基化（differential methylation）。

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图2-19 印记基因差异性表达

BWS患者染色体11p15.5区段的一个长约1Mb（相当于1000kb）的片段中至少有12个成簇排列的印迹基因(imprinted genes)，其中有些呈父源等位基因表达模式，另一些呈母源等位基因表达模式，这些基因分属两个印迹域(imprinted domain)，它们的印迹状态分别受控于两个印迹调控区(impriting control regions，ICR)。BWS提供了一个具有一定典型意义的研究印迹机制的模型（图2-20）。在第一个印迹调控区，主要有印迹基因胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor 2, IGF 2)基因，H19基因，和一个富含CpG岛的差异甲基化区域(differentially methylated region，DMR)，三者的排列次序是：5’-IGF2-DMR-H19-3’。IGF2是一种父源等位基因表达的胚胎生长因子，它的表达上调对BWS的病理过程非常重要。H19是一种母源等位基因表达的polⅡ转录子，它的转录物是丰度很高但功能不详的非编码RNA，并不翻译为蛋白质。DMR是一个印迹调控区，有染色体屏障调节蛋白CTCF结合位点，具有染色质隔离子(insulator)功能，（图15-2）H19和IGF2的表达要竞争位于H19 3’下游的一个增强子。在母源染色体上，DMR1是非甲基化的，它允许CTCF与它相结合，从而隔断了IGF2和位于H19下游的增强子，所以该增强子只活化H19的转录。在父源染色体上，DMR1是甲基化的，它不仅使H19基因沉默，CTCF也因此不能与之结合，结果是父源IGF2基因在增强子作用下活化表达。由此可见，DMR的差异性甲基化对IGF2和H19的表达起到了交互易换式的印迹调节(reciprocal imprinting regulation)作用。

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图2-20 Igf2-H19印迹机制的模型

迄今发现的印迹基因已有100多个，分布于整个基因组区域，大多成簇排列，这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位点被称做印记中心(imprinting center, IC)，其中有许多是疾病基因。印记丢失不仅影响胚胎发育并可诱发出生后的发育异常，从而导致癌症发生。如果抑癌基因有活性的等位基因失活便提高了发生癌症的几率，例如IGF2基因印记丢失将导致多种肿瘤,如Wilm’s 瘤。和印记丢失相关的疾病还有成神经细胞瘤，急性早幼粒细胞性白血病，横纹肌肉瘤和散发的骨肉瘤等。与基因组印记相关的疾病常常是由于印记丢失导致两个等位基因同时表达，或突变导致有活性的等位基因失活所致。调控基因簇的印记中心发生突变将导致一系列基因不表达，引发复杂综合征。基因组印记的本质仍为DNA修饰和蛋白修饰，所以和印记相关的蛋白发生突变也将导致表观遗传疾病。 基因组印记异常与肿瘤的相关。例如BWS患者的Wilm’s瘤的发病率比对照群体高出1000倍。对肺癌，神经胶质瘤（glioma），乳腺癌和结肠癌的分析表明IGF2等基因的印迹丢失（loss of imprinting，LOI）是肿瘤危险因子，也是最常见的表观遗传改变。LOI的机制还涉及到CTCF和另一种印迹调控蛋白BORIS（brother of regulator of imprinted sites）在染色体上的结合靶位的甲基化状态的改变，以及印迹调控蛋白质复合体对染色质结构重塑的影响。

三、X染色体失活

1961年，M.F.Lyon提出了雌性哺乳动物体细胞的两条X染色体中会有一条发生随机失活的假说，认为这是一种基因剂量补偿（dosage compensation）的机制。X染色体失活发生在胚胎早期（第16天），X染色体的失活是随机的，在一个细胞中，有一条X染色体是完全失活并呈异染色质状态，而在另一个细胞中同一条X染色体又可以是活化的且呈常染色质状态。但一旦失活状态建立，就会在细胞谱系中稳定地遗传下去。因此，X染色体失活是典型以整条染色体为目标的表现遗传现象。

有关X染色体失活的机制近年来才逐渐被认识。X染色体的Xq13.3区段有一个X失活中心(X-inaction center)，X-失活是从Xic区段开始启动，然后扩展到整条染色体的。Xic长约1Mb，包括4个已知基因：Xist、Xce、Tsix、和DXPas34，X染色体失活特异性转录子（X-inactive specific transcript，Xist）基因是X染色体上启动转录最早的基因，但它的转录产物不编码蛋白质。两条X染色体的Xist 基因都能从上游启动子启动Xist RNA的稳定转录，其中一条 X染色体产生的Xist RNA将这条染色体自身整体包裹，并启动异染色质化和失活过程。而另一条X染色体转录的Xist RNA会很快裂解，这条X染色质则呈常染色质状

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态，整条染色体上的基因都具有表达活性。X染色体调控因子（X-chromosome controlling element，Xce）基因与X-染色体的随机失活中的选择有关，当Xce处于纯合状态时，在体细胞中的X-失活是完全随机的，而在杂合态时，失活就不是完全随机的。基因Tsix是位于Xist下游的瞬时调控元件，包含CTCF的结合位点。DXPas34基因富含CpG，包括一个15Kb的微卫星重复序列，对X-失活有一定调控作用。失活X染色体有两个显著特点，一是组蛋白H4 不被乙酰化；二是CpG岛的高度甲基化，X染色体失活的分子机制还有待于进一步阐明，是今后表观遗传学研究的重要内容。

图2-21 IX染色体失活的机制

和X染色体失活相关的疾病多是由X染色体的不对称失活使携带有突变等位基因的X染色体在多数细胞中具有活性所致。Wiskott-Aldrich综合征表现为免疫缺陷、湿疹、伴血小板缺乏症，该病是由于WASP基因突变所致。因为染色体随机失活导致女性为嵌合体，携带有50%的正常基因，通常无症状表现，该病患者多为男性。存在女性患病的原因在于不对称X染色体失活，即携带有正常WASP基因的染色体过多失活。但女性体内还存在另一种机制，通过不对称失活使携带有突变基因的X染色体大部分失活。对Pelizaeus-Merzbacher病的研究表明这种机制的存在，它使带有突变PLP基因的X染色体倾向于失活。RTT综合征也和不对称X染色体失活有关，携带有MeCP2突变基因的女性，X染色体失活时倾向于使携带有发生突变的等位基因的染色体失活。

即便是失活的X染色体，也有一部分基因可以逃避失活而存在两个有活性的等位基因，但逃避失活的等位基因的表达水平有很大的差异。由于逃避失活而易使一些抑癌基因丧失功能，这是引发女性癌症的一个重要原因。也有一些逃避失活的基因过量表达而增加某些疾病的易感性，如TIMP1基因随着年龄的增加表达量逐渐增加，导致迟发型疾病。女性易感的自身免疫性疾病也和X染色体失活相关，因为女性为嵌合体，如果自身免疫性T细胞不能耐受两个X染色体所编码的抗原，则会导致自身免疫缺陷性疾病，如红斑狼疮等。

四、表观遗传与肿瘤

R.Holliday在1979年就提出DNA甲基化可能在癌变过程中起着重要的作用。近年来通过对DNA 甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的DNA 甲基化状态。肿瘤中基因组整体甲基化水平降低，导致遗传不稳定性增加；许多癌基因启动子区多为表现为甲基

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化，使癌基因重新开放或异常表达。除了DNA甲基化的总体水平降低之外，癌细胞往往出现局部序列的高甲基化，高甲基化通常集中在抑癌基因启动子附近的GpG岛，导致抑癌基因的失活。迄今为止，关于肿瘤抑癌基因的失活与该基因的启动子区域CpG 岛的过度甲基化的直接关系有大量的报道。许多与细胞生长增殖相关的基因，如与细胞周期相关的基因pRB、p16、p15、和p73，以及与DNA 损伤修复有关的基因，如BRCA1 和hMLH1 等，它们启动子区域的异常甲基化都与该基因的失活有关，表明DNA甲基化的异常是癌细胞中某些抑制恶性生长的基因沉默的原因。研究表明，不同的人体组织同一种基因的甲基化状态可以有非常明显的差异，证实DNA甲基化在不同组织上具有不同模式，这为肿瘤的早期诊断提供了一定的依据。一些研究者将微阵列技术先后应用于乳腺癌、肺癌和卵巢癌等肿瘤CpG 岛甲基化研究，获得的CpG岛甲基化谱不仅可作为上述肿瘤患者的早期诊断指标，还与肿瘤的病理分型、药物治疗敏感性和预后判断直接相关。

许多研究已证实了组蛋白高/ 低乙酰化在肿瘤发生中起重要作用。一方面，组蛋白乙酰化和脱乙酰化的变化与肿瘤细胞的形态变化有关；另一方面，催化组蛋白乙酰化的HAT或催化组蛋白脱乙酰化的HDAC可与一些癌基因和抑癌基因产物相互作用，从而修饰或介导这些产物对与细胞分化和细胞增殖有关的基因转录的作用。在组蛋白的诸多修饰方式中，磷酸化主要影响信号传导通路中相关基因的转录。例如组蛋白H3 Ser10磷酸化在真核生物的基因转录活化中起重要作用，ERK- MAPK途径以及p38MAPK途径均能诱导H3 磷酸化，组蛋白H3 的快速磷酸化常伴有癌基因c-fos 和c-jun的活化。此外H3 Ser10 磷酸化对有丝分裂的启动非常重要，这种修饰发生在G2 期初始阶段，促使染色质凝集。

由于肿瘤发生中的DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学改变是可以逆转的，因此在肿瘤或癌前病变中，通过抑制DNA甲基化和抑制组蛋白的脱乙酰基作用可以恢复抑癌基因的表达，从而达到防治肿瘤的目的（图2-22）。例如特异性地抑制Dnmt 活性，如竞争性底物(发夹式半甲基化寡核苷酸)、核苷类似物(5-aza、5-azadC)、小分子抑制物(SAH)、反义寡核苷酸等，可使CpG岛甲基化转录失活的抑癌基因如p14、p15、p16、p21、p53、Rb 等恢复功能，从而逆转肿瘤细胞生物学活性。5-aza和5-aza-dC可以有效抑制Dnmt 活性，在白血病、骨髓增生异常综合征、非小细胞肺癌等肿瘤中已经取得了很好的疗效。HDAC 抑制剂抗肿瘤机制包括阻滞细胞周期和促进细胞分化，诱导细胞凋亡，抑制血管生成等。已有多种HDAC 抑制剂对白血病和实体瘤进行了I 期和II 期临床试验，包括丁酸盐、SAHA、MS-275、CI-994 等，显示了良好的疗效，副作用很少，这说明与传统的化疗药物相比，HDAC 抑制剂具有较大的优势。近年来的研究表明，HDAC抑制剂和其他抗肿瘤药物的联合使用具有更加广阔的应用前景。例如联合应用Dnmt 抑制剂和HDAC 抑制剂可以重新激活MLH1、TIMP3、CDKN2B、CDKN2A 和ARHI 等抑癌基因，促进肿瘤细胞凋亡。

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图2-22 抑制DNA甲基化和组蛋白去乙酰化对肿瘤的影响

肿瘤的发生常常涉及多个抑癌基因的失活，针对单一基因的治疗不足以抑制肿瘤生长，甲基化或脱乙酰化酶抑制剂针对的是整个基因组而不是特定的基因，可同时恢复多个抑癌基因的表达，并降低基因突变的发生率，提高基因组稳定性，可能为药物开发提供新的靶点。

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