农虫论文：应用转基因技术治理害虫的研究进展(2)

用的ICP。由编码的ICP本身没有生物活性，一般称为原毒素(protoxin)。原毒素被敏感昆虫摄入后，在中肠的碱性环境下，被特定的蛋白酶水解成分子量约为40—70kD的蛋白，即形成了具有特异杀虫活性的毒素分子。它可穿过包被的围食膜到达中肠上皮柱状细胞，与刷状缘膜)上特异的高亲和受体位点进行识别，然后可逆的结合到受体上。在受体的帮助下毒性分子的部分结构迅速而不可逆地插入质膜[10]。ICP含有多个疏水的α螺旋和亲水亲脂的α螺旋组成的螺旋束。它们一起插入磷脂双分子层中，从而使细胞膜上形成孔道。这些孔道允许正、负离子以及一些寡糖如麦芽糖、蔗糖或棉子糖的通过，从而破坏了细胞的离子平衡最终导致细胞的破裂。 2.1.1.3单Bt转基因抗虫植物

随着新的Bt不断分离及其ICP杀虫谱的鉴定，研究者开始对具有较好杀虫能力的Bt进行有效的改造。对Bt的修饰最早是在1990年，修饰改造的crylA(b)和crylA(C)在转基因棉花(Gossypium hirsutum L．)中的表达水平大大提高，ICP含量为植株可溶性总蛋白的0.05％～0.1％，达到了抗虫目的，从而使转Bt作物在农业生产上的应用成为可能。将人工改造合成的crylC导入紫花苜蓿(Medicago sativa L．)和烟草中表达，转基因植株中ICP为可溶性总蛋白的0.01％～0.2％，并对灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)表现出较高水平的抗性。将crylC修饰改造后导人花椰菜(Brassica oleracea ssp．)中，也获得了对小莱蛾(Diamondback moth)幼虫具有高抗性的转基因株系。将crylEc导入蓖麻中，获得的转基因植株对斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabr)和蓖麻夜蛾(Achoea nata L．)两种食叶害虫都表现出明显的抗性。

2.1.1.4 复合Bt转基因抗虫植物

虽然修饰过的Bt在植物中的表达量大大增加，也产生了有效抵抗害虫侵食的Bt转基因植物。但是随着Bt转基因植物的大面积种植，昆虫对其产生抗性成为一个不容忽视的问题。延迟昆虫抗性的一个重要的方法就是将两个不同的抗虫基因转入同一植物中，这两个基因可以是一种Bt和一种非Bt抗虫基因的组合，也可以是两种Bt的联合。 2.1.1.5 Bt在植物抗虫基因工程中的应用

自从1987年我国首次获得转Bt基因的烟草和番茄以来，相继获得了转Bt基因的棉花、水稻、玉米等。为了解决我国棉花生产受棉铃虫严重危害的问题，在国家“863”计划的支持下，中国农业科学院生物技术研究所成功地人工合成和改造了Bt基因，并与江苏省农科院和山西省农科院等单位合作将Bt基因转入到我国长江、黄河流域的棉花主栽品种，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花品种和品系。抗虫棉的总体抗虫能力达80％ 以上，丰产性、适应性与

当地主栽品种相当。目前已经有4个抗虫棉品种通过审定并进行推广。拥有我国自主知识产权的抗虫棉花的育成和大面积推广应用，标志着我国转基因植物研究开始进入产业化发展阶段。将具有不同杀虫机理的两个基因同时导入植物能有效地延缓棉铃虫抗性的形成，因而能增强抗虫棉的持久抗虫性。这一成果进一步显示了我国抗虫棉研究的特色，具有更为广阔的应用前景[11]。

农科院的研究表明，Bt棉花对非目标昆虫及人畜是无毒的。其原因在于，Bt晶体蛋白是一种无杀伤活性的前体蛋白，只有在鳞翅目昆虫肠中的碱性条件下才可以转化为有活性的成熟蛋白，它与昆虫肠细胞表面受体结合，造成肠道穿孔从而把昆虫杀死。然而人畜肠胃系统是酸性的，不存在使前体蛋白成熟的条件，况且肠道细胞的表面也不存在与Bt蛋白结合的受体。其它非目标昆虫体内也不同时具备Bt蛋白晶体作用的两个重要条件，所以对目标害虫以外的生物不会构成威胁[12]。

然而, 随着Bt使用量和转Bt基因作物的迅速增长, 转入的Cry基因在作物体内持续表达, 使害虫在整个生长周期都受到Bt 杀虫蛋白的高压选择,因而害虫对Bt 的抗药性已成为一个不容忽视的问题。自1985年McGaug hey报道印度谷螟( Plodiainterp unctella) 对Bt产生抗性以来, 国内外已经发现室内至少有10种蛾类、2种甲虫、4种蝇类对Bt产生了抗性，其中小菜蛾( Plutella xylostella)是惟一在田间对Bt产生抗性的昆虫。2003年Janmaat等、Kain等又发现, 温室中的粉纹夜蛾( Trichop lusia ni ) 对Bt存在抗性, 这是继小菜蛾后又一个实验室外昆虫对Bt有抗性的报道, 而且许多实验室已经获得了抗Bt作物的害虫品系。这些研究都表明, 多种害虫具有对Bt产生抗性的潜在危险。因此，大面积使用Bt制剂和种植Bt作物，昆虫对Bt抗性的产生只是一个时间问题[13]。 2.1.2植物来源的抗虫基因利用

植物自身对害虫也有一定的防御能力，如植物自身可合成某些抗代谢物，干扰昆虫的消化过程。

2.1.2.1蛋白酶抑制剂(Proteinase inhibitors)的应用

植物蛋白酶抑制剂是一类含量较为丰富的蛋白质，是一种天然的杀虫物质，分子量小，性质稳定，与B 基因相比，由于其具有抗虫谱广，安全性高和害虫不易产生抗性等优点而广泛用于抗虫基因工程[14]。它能与昆虫消化道的消化特异蛋白的蛋白水解酶相互作用，形成酶一抑制剂复合物，抑制蛋白酶活性，阻断或减弱消化酶的水解蛋白质作用。所以，昆虫一旦摄食蛋白酶抑制剂就会影响对外来蛋白质的消化，最终造成昆虫的非正常发育或死亡。按其作用特异性，蛋白酶抑制剂可分为4类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、半

胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂。不同蛋白酶抑制剂可以特异性地作用于特定的昆虫群体。目前已获得转化植株的蛋白酶抑制剂基因有：大豆胰蛋白酶抑制剂基因(SKTI)、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)、慈菇胰蛋白酶抑制剂基因(API)等几类；其中获得转CpTI基因的植物种类最多，有苹果、油菜、水稻、番茄、向日葵、甘薯、烟草、马铃薯等10余种

[15]

。在抗虫研究中应用较多的蛋白酶抑制剂是从豇豆得到的CPTI基因，它编码胰蛋白酶／

胰凝乳蛋白酶抑制剂。现已成功地把CPTI基因转化到其他植物，有效地抵御了多种昆虫的危害。

2.1.2.2淀粉酶抑制剂(d—Amylase inhibitors／d—AI)的应用

α一淀粉酶抑制剂在植物界中普遍存在，尤其在豆科和禾谷类植物的种子中，含量更为丰富。α一淀粉酶抑制剂作用机理在于：这类酶抑制剂能抑制昆虫消化道内α一淀粉酶活性，使摄入的淀粉无法水解，阻断了昆虫主要能量来源，并刺激昆虫过量分泌消化酶，通过神经系统反馈产生厌食反应，从而使昆虫致死。 2.1.2.3凝集素(Lectins)的应用

外源凝集素是糖结合蛋白，存在于多种植物中，特别是富含于植物种子或储藏器官中。外源凝集素的作用机理在于：一旦外源凝集素被害虫摄取，它就从植物细胞的蛋白粒中释放出来，与昆虫肠道围食膜上的糖配体结合，影响营养物质的正常吸收。但确切的作用机制仍不清楚

[16]

。外源凝集素基因(GNA)至少在油菜、西红柿、水稻、甘薯、甘蔗、向日葵、烟草、

[17]

马铃薯、大豆和葡萄等1O种植物上获得了表达，均表现出一定的抗虫性。目前研究较多且

成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有：雪花莲凝集素(GNA)基因、豌豆凝集素(P—Lec)基因、麦胚凝集素(WGA)基因和半夏凝集素(PTA)基因。 2.1.2.4来源于高等植物的其他抗虫基因

来源于高等植物的其他抗虫基因有几丁质酶(Chitinase)、色氨酸脱羟酶(Tryptophan Decaiboxylase，TDC)、核糖体灭活基因(Ribosome Inactive Protein，RIP)、豌豆脂肪氧化酶(Pea lipoxygenase)、番茄素(Tomatime)、多酚氧化酶(PPO)和脂氧化酶(LOX)都对昆虫有毒害作用

[18]

。

2.2害虫的转基因遗传防治策略

用遗传方法防治害虫的观念是在20世纪40年代首先提出来的，之后F．Kripling和S．Serebrovsky提出了类似的方案：使同种昆虫的不育成员充满一个害虫种群，导致大多数交配不能产生正常发育的后代，而有害基因又可以通过少数有效的交配继续向后代转播，现在，这种策略被称为不育昆虫技术(sterile insect technique，SIT)[19]。

然而这种方法在多数害虫防治中应用潜力有限，主要因为释放的不育雄虫在性选择中不能与自然种群的雄虫相竞争。有人提出一种遗传防治害虫的新设想, 称为武装转座子—靶标昆虫防治策略(Transposonswith Armed Cassettes-Targeted Insect Control Strategy, 简称TACTICS) 。首先构建TAC基因结构, 由转座子与条件表达的危害昆虫的基因组成, 将这一结构转入靶标害虫, 获得的转基因害虫释放于环境。在害虫种群密度低的时候, 有害基因并不表达, 而是借助转座子可移动的本性, 通过转基因昆虫与自然种群的个体交配, 在后代中迅速扩增蔓延, 直至种群的绝大多数都带有TAC 基因结构。在靶标害虫爆发的年份, 通过施放诱导因子激活潜在的有害基因, 使害虫死亡或丧失危害能力, 而诱导因子对食物链中其他生物没有影响。上述设想变成现实需具备以下条件：(1)基因导入虫体的方法；(2)基因在目标昆虫种群中传播或驱动的体系；(3)使昆虫死亡或丧失危害能力的基因；(4)条件启动子。目前有关昆虫转化的研究报道, 主要集中在果蝇上, 且多以P因子为载体, 将外源DNA 显微注射到果蝇早期的胚胎中, P 因子可被种系DNA 整合并稳定保持。除P 因子外, 近年来新发现一些因子如hobo、mariner、Hermes 和I转座因子也可用于果蝇等昆虫的转化, 不过至今在其他昆虫上转化成功的例子尚很有限。转座子自从1948 年首次被Barbara McChlintock 和Mar cusRhoades 在玉米中发现到现在，已被证明在有机体中普遍存在。由于转座子具有以下特性:(1)能通过交配遗传；(2)自身可复制相当的拷贝并能整合于基因组的不同位点；(3)其可移动性一般限于某一基因组。因此，要在有限的世代内使潜在有害基因扩散到整个群体, 转座子是较理想的选择。目前, 除果蝇外, 我们对其他昆虫转座子的性质所知甚少。在昆虫有害基因方面, 数种毒素基因如蝎毒、苏云金杆菌内毒素基因已被广泛应用, 但比较理想的是昆虫本身的基因, 如与昆虫激素和神经肽有关的基因, 因为可调控它们在错误的组织或发育时间表达, 使昆虫不能正常生长发育, 且仅作用于靶标昆虫。最近有数种这类基因被克隆, 如与咽侧体抑制促进激素、蜕皮激素、利尿激素、保幼激素酯酶、外激素生物合成激活神经肽等有关的基因。这一系统中, 对条件启动子的要求很苛刻, 它必须能被严格调控, 诱导物在害虫生境中一般不得存在, 并且成本合适、与环境协调。在昆虫中研究最多的为热休克蛋白hsp70 启动子, 它在果蝇和鳞翅目昆虫细胞系中有很强活性, 但在实际中用于调控尚不够精确。研究和利用双激活启动系统可能会弥补这一不足。 2.3天敌的转基因增效策略

利用昆虫病原微生物和天敌昆虫是害虫治理的有效方法, 但在应用中也存在一定的缺陷,如昆虫病原微生物的控害效力低、作用时间长,天敌昆虫对化学农药敏感等。基因工程可将外源杀虫基因转入病原微生物, 提高昆虫病原微生物的效力, 加速害虫的死亡。在杆状病

毒遗传工程研究中, 利用驱动多角体蛋白表达的强启动子可使外源杀虫蛋白超量表达。现已将苏云金杆菌内毒素基因、多种神经毒素基因转入杆状病毒, 有效地缩短了杆状病毒的杀虫时间。一些与昆虫激素有关的基因也被尝试转入杆状病毒。苏云金杆菌内毒素基因已转入荧光假单孢杆菌等多种其他细菌。这些工作在我国亦已开展。基因工程在增加天敌昆虫的抗药性、耐寒和耐热性以及消除滞育等方面有所作为。利用生物技术培育的无飞翔能力的寄生蜂Microp lit iscroceip es 有望释放入棉田防治棉铃虫[20]。 3转基因技术治理害虫的意义

该途径是害虫综合治理的重要方面之一，有利于实现害虫的可持续治理，开拓了作物有害生物综合治理(IPM) 技术的新领域和新途径[21]转基因技术具有非常广泛的应用前景, 特别是利用转基因作物相对于一些常规防治技术来说具有自身的特点和优势, 也符合社会发展的需要：1通过种植抗虫、抗病或抗(耐) 除草剂作物，不仅能有效地控制有害生物的危害, 特别是对一些难以防治的有害生物，如种植Bt玉米就能比传统方法包括化学防治更有效地控制玉米螟，种植转基因水稻可以有效地防治水稻螟虫；2不同程度地减少使用化学农药, 保护环境；3使农田耕作管理更容易；4 省工、省时、增产增收。转基因作物大多数用于改进害虫或病原体的防治[22]。转基因作物对害虫防治的潜在益处很大，可改进有效成分击中靶标物；可保护植物整个生长季节，减少使用者对高毒农药的接触，简单有效地防治害虫而无需昂贵、复杂的施药器械；使农药使用减少，降低成本，保护环境；能持续的防治害虫。. 4转基因生物的风险及安全性

关于转基因作物的潜在生态风险早在1992年公布的《生物多样性公约》条款中就已明确提出来，要求制定或采取办法酌情管制、管理或控制由生物技术改变的活生物(LMO或GMO)在使用和释放时可能产生的危险，既可能对环境产生不利影响，从而影响到生物多样性的保护和持续利用，也要考虑到对人类健康的危险。

保护环境是人类生存的基础。生物有机体基因改变后, 其安全性受到全球各国的普遍关注,许多国家制定了管理转基因生物释放的法规评估转基因生物利用的风险性, 至少须从以下方面考虑：(1) 该生物的自然属性, 如其起源、所在营养水平、寄主范围及其他生态学关系、在基础生态系统中的地位、在环境因素胁迫下的存活力、与其他种群基因交换的潜在能力等; (2) 遗传改变的属性, 如遗传改变的目的、本质、功能以及稳定性等; (3) 生物在遗传改变前后的属性差异, 如寄主范围、治虫的有效性、性状的表达水平、对自然和人工控制因素的敏感性等; (4) 所在环境的属性, 如潜在的寄主情况、对共存濒危物种的可能影响、转入基因向其他生物横向转移的可能性、基因迁移扩散情况、试验的代表性等; (5) 监测、控制

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