《微生物学及实验》实验指导书(4)

2.2.3 挑菌落

同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 3、常用四种接种方法操作指导：

斜面接种法：斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～50度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。

液体接种法：多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下：由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。

固体接种法：普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。

穿刺接种法：此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。

五、实验结果

实验结果应该以所做涂布平板法和划线法较好地得到了单菌落为目的，如果不是，请分

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析其原因并重做。

六、思考题

1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？在平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。

2、为什么高氏I号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？

3、试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则?

4、以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。 5、试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌。

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实验五 有机污染物质的生物降解实验

实验项目性质：综合性实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：4学时

一、实验目的

1、掌握微生物在环境污染物降解中的原理和重要作用； 2、掌握污染物测定的测定方法。

二、实验原理

有机污染物广泛存在自然环境中，绝大多数污染物可以在微生物的作用下被降解，本实验以表面表面活性剂为模式有机污泥物进行生物降解实验。表面表面活性剂是合成洗涤剂的主要有效成分，目前应用较多的是直链型烷基苯磺酸盐类(LAS)。环境中表面活性剂的消失几乎全靠微生物的作用，微生物通过其特殊的酶系的降解能力受到菌株类型、表面活性剂浓度及其他多种物理化学因素的影响。本实验应用一株由处理洗涤剂工业废水的塔式生物滤池中分离得到的LAS降解菌，考查不同起始浓度LAS对微生物降解度的影响。

三、器材与用品

1.菌种：气单胞菌D-4(Aeromonas sp．D-4，可由中国科学院水生生物研究所提供)；YM8菌株（由本实验中心在活性污染中分离）。

2.培养基

合成洗涤剂*（含LAS者）：0.02-0.12%；蛋白胨：0.5%；NaCl：0.5%；NH4NO3：0.5%；KH2PO4：0.1%；K2HPO4：0.1%；蒸馏水：100ml。调节pH至6.7-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

*分别配制四种含不同LAS浓度的培养液，使其LAS含量为40、120、180及240mg/L。可根据所采用的洗涤剂型号中LAS含量换算，再经实测（LAS测定见本实验“测定方法”项）。培养液分装于500ml三角瓶，每瓶注100ml，不同LAS浓度标记清楚，121℃高压蒸汽灭菌20分钟备用。

3．美蓝溶液：称取100 mg美蓝溶于蒸馏水后稀释至100ml。移取该液30ml于1000ml容量瓶中，加 6.8ml分析纯浓H2SO4及50g NaH2PO4·2H2O, 用蒸馏水溶解后加入容量瓶并稀释至1000ml刻度处。

4．LAS标准溶液：称取纯LAS 0.5g(99.5%LA S标准品可由上海有机化学研究所提供)，溶于蒸馏水，稀释至500ml，此液LAS浓度为1mg/ml。取此液10ml稀释至1000ml,则LAS浓度为0.01mg/ml。

5．洗涤液：取6.8ml分析纯浓H2SO4及50g NaH2PO4·2H2O ,溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 6．恒温振荡器。

7．分光光度计(具波长652nm)。 8．离心机。

9．500ml三角瓶、250ml分液漏斗、50、100、500及1000ml容量瓶、量筒、吸管、脱脂棉等。

四、方法和步骤

1．接种：取气菌株斜面菌种1支，以10ml无菌水洗下菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌

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液。每瓶培养液中接入菌液1ml；每种LAS浓度接2瓶，另设1瓶不接种作对照。

2．培养：将接种与不接种之对照瓶置震荡器上，控制转速为170-220r/min，于32±1℃恒温震荡培养48小时。培养结实时,将培养液离心以除去菌体(8000r/min离心10分钟或4000r/min离心30分钟)。离心后之上清液留作测定LAS用。

3．LAS测定：LAS和美蓝可生成蓝色化合物，并溶于氯仿等有机溶剂中。

(1)制备标准曲线：取0、2、5、10、15、20 ml LAS标准液(0.01mg/m1)分别稀释至100 ml制成不同浓度标准液。将标准液100ml装于250 m1分液漏斗中，用H2S04调节pH至微酸性，加美蓝液25ml。

① 氯仿提取：向上述分液漏斗中加氯仿10ml，猛烈振荡30秒钟，静置分层，将氯仿层排入另一个250m1分液漏斗中。如此提取三次。

② 洗涤：在上述接纳了三次氯仿提取液的分液漏斗中加入50ml洗涤液，猛烈振荡30秒钟，静置分层。将一小块脱脂棉塞入分液漏斗活塞下部以滤除水珠，分液漏斗中的氯仿层缓缓放下至一个50 ml容量瓶中。

③ 再次提取：加氯仿6ml于上述②分液漏斗的水液中,振荡分层后将氯仿层并入上述②容量瓶中。如此提取三次。然后用氯仿将容量瓶中液体稀释至50 ml刻度处。

④ 测定LAS：用纯氯仿做空白对熙，用分光光度计固定波长为652nm，测定各标准液的光密度值(OD)。以光密度值作纵坐标，LAS的毫克数(LAS原标准液浓度0.01mg/ml×所取该液的ml数)作横坐标，制取标准曲线。并通过图解法求出标准曲线的斜率K。

(2)培养液测定：吸取离心后的培养液上清液1-10ml，放于250m1分液漏斗中，用蒸馏水稀释至100ml。以下步骤同绘制标准曲线时的步骤，测得样品的氯仿提取液之光密度值。按下式计算样品中LAS浓度。

LAS(mg/L)＝OD652×1000/（标准曲线斜率×水样体积）×100%

4．LAS降解度计算

D＝（C0－Ct）/C0×100%

D：降解度%

C0：振荡培养开始时的起始LAS浓度(mg/L) Ct:：振荡培养若干小时后的残留LAS浓度(mg/L)

如果未接菌液的空白对照液经培养后，LAS也有所减少，且其差值为C(mg/L)，则

D＝｛C0－(Ct+C)｝/C0×100%

五、实验结果及报告

将实验结果填入下表。

表 LAS起始浓度对微生物降解度的影响

180 起始LAS浓度（mg/L） 不接

接种 不接种 接种 不接种 接种

种

培养后残留LAS浓度

降解度（%）

40

120

240 接种 不接种

六、思考题

1、实验结果说明了什么问题？

2、参考本实验设计一个污染物微生物降解实验（要求有污染物的测定方法）。

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实验六 双歧杆菌酸口服液的发酵制备

实验项目性质：综合性实验 所属课程名称：《微生物学及实验》 实验计划学时：4学时

一、实验目的

1、学习分离和纯化菌株的方法； 2、学习营养口服液的制作方法及过程；

3、初步了解食品药品生产时的管理规定和技术标准。

二、实验原理

双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌等对人体有明显有营养保健作用，是微生态试剂的重要生产菌株。双歧杆菌是一种厌氧菌和微好氧菌株，它对生存环境的要求非常苛刻，易受氧、水分、光线、保护基质等条件的影响。微好氧菌株经过驯化，能承受一定氧压，既有利于生产，又能促进正常菌群生长和繁殖。在西红柿和豆粕煮汁中等中含有小分子蛋白、双歧杆菌生长因子和低聚糖等物质，能选择性增殖双歧杆菌。乳酸杆菌和乳酸球菌产酸快，从而为双歧杆菌提供较低的pH值环境，对它的生长繁殖有促进作用，因此选择乳酸杆菌和乳酸球菌作辅助发酵菌株。

与此同时双歧杆菌代谢后会产生醋酸及乳酸，使培养液呈酸性，虽能抑制有害菌的生殖，但如果pH值过分降低也使菌体其自身受到酸性的影响，因此在含活菌的活性营养口服液中大多添加磷酸盐等缓冲物质，防止pH过分偏低，延长产品中活菌的保持期并保持其保健作用。

三、材料与方法

(一) 实验材料 1、菌种：

双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌由本实验室筛选，经权威部门鉴定符合生产和临床使用标准。 2、培养基：

2.1 改良TJA培养基（培养双歧杆菌用）：番茄汁50mL；酵母浸出物5g；肉膏lOg；乳糖20g；葡萄糖2g；K2HPO4 2g；Tween80 1g；醋酸钠2.5g；琼脂15g。

2.2 BL培养基（培养乳酸菌用）：番茄汁400mL；蛋白胨15g；酵母浸膏6g；肝浸液45 mL；葡萄糖20g；可溶性淀粉0.5g； NaCl5g；Tween80 3ml；L-Cys 0.5 g；蒸馏水1000mL；pH7.2。

2.3 去脂TJA培养基：在改良TJA培养基配方的基础上减去琼脂。

2.4 发酵培养基(生产发酵液)：番茄汁1 ml；酵母浸出物1g；乳糖1g；葡萄糖1g；K2HPO4 0.1g；Tween80 0.1ml；3%豆粕浸汁100ml。灭菌温度在115℃，时间20min。 3、青春型双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌的发酵菌种：

试管斜面—→转种50 mL试管—→250mL三角瓶—→测定菌量、酸度和pH值。 液体接种量为3%，摇床振荡培养。 (二) 实验方法

1、菌株活化及发酵剂制作

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