四川理工学院微生物菌种选育实验指导(3)

在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生。另一方面又可避免长出不纯菌落。 3、方法

(1) 菌龄：对数期细胞、刚成熟的孢子或活化的孢子

(2) 菌悬液浓度：一般真菌孢子或酵母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、放线菌或细菌的浓度为108个／mL左右。菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度计数。

(3) 菌悬液的配制方法：

离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min，令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。 （五）诱变处理 1、诱变剂种类的选择

常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、γ射线(如Co60等)、等离子、快中子、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。物理诱变剂中最常用的有紫外线。

(1) 根据诱变剂对基因作用的特异性选择 (2) 根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 (3) 参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂 2、最适诱变剂量的选择 (1) 诱变剂剂量的表示方式

各种诱变剂有不同的剂量表示方式： 1) UV的剂量指强度与作用时间的乘积。

2) 化学诱变剂常以在一定外界条件下诱变剂的浓度和作用时间的乘积来表示。 3) 在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂的相对剂量。 (2) 最适诱变剂量的确定 1) 确定依据

诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。 2) 确定方法

通过比较剂量—存活率曲线和剂量—诱变率曲线，找到某诱变剂的剂量—存活率—诱变率三者的最佳结合点，即为诱变剂的最适剂量。

① 剂量—存活率曲线

以诱变剂的剂量为横坐标，以细胞存活率的对数值为纵坐标绘制的曲线。

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② 剂量—诱变率曲线

以诱变剂的剂量为横坐标，以诱变后获得的突变细胞数为纵坐标绘制的曲线。 一般以诱变后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。 3) 紫外诱变的方法

① 将10m1菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10min左右。

为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。

② 设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。

在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。

③ 实验中避免光复活现象。

实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。 3、诱变剂的处理方式

诱变剂的处理方式，可分为单因子处理和复合因子处理。 (1) 单因子处理

采用单一诱变剂处理出发菌株。 (2) 复合因子处理

指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。 （六）后培养

对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原酶有量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。 （七）突变株的分离与筛选

突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条件决定选育的方向，因为突变

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体高产性能总是在一定的培养条件下才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的特定条件下可以筛选到具有新性状的菌株，其他原养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是决定菌种某些持性保留或淘汰的“筛子”。

为了有效地选出突变株，必须采用使新个体表型得以充分表达的筛选条件。 1、筛选方案：

在实际工作中，一般认为应采用把筛选过程分为初筛与复筛两个阶段的筛选方案为好。前者以量(选留菌株的数量)为主，后者以质(测定数据的精确度)为主。 2、筛选方法

(1) 随机筛选

也称摇瓶筛选。该法主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选。具体做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，然后一个斜面的菌体接入—只锥形三角瓶、放置在摇瓶机上振荡培养，根据测定产物活性的高低，决定取舍。这种筛选法的优点是：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。摇瓶中的通气量可以通过调整转速、装量和瓶内加档板等方法加以控制。

在突变概率小的情况下，如果菌落挑取少了，很难筛选到理想的突变株。根据瑟芝帝工作法，高产菌株概率愈低筛选菌落数量就越大，如果突变频率为1％、那么初筛挑选菌落起码要200个。

(2) 平板菌落预筛

平板菌落筛选，是在培养皿或特制玻璃框平板上进行的，是用于诱变后从试样小检出突变体的一种琼脂平板筛选法。实际上是摇瓶初筛前的一种预筛，应该说是初筛的—部分。通过预筛可以淘汰那些低产菌株。平板筛选技术种类很多，有的是根据菌落形态淘汰低产菌株，有的则利用每个菌落产生的代谢产物与培养基中检定菌、底物或指示性物质作用后，在其周围形成抑菌圈、呈色圈或其他特异性反应圈，通过测量反应圈白径与菌落直径之比值，来衡量突变株的产量高低。

常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。 3、摇瓶液体培养

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常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培养，而平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜面，然后再进行摇瓶液体培养，才能逐步地筛选出高产菌株。 4、产物活性别定

活性测定是菌种筛选工作的重要组成部分，也是决定筛选效率的主要因素。根据一般突变规律，一个出发菌株通过一次诱发突变，生产能力提高5％的变株约1／50，而生产能力提高10％以上的变株仅在1/300左右。由此可见，初筛的菌株越多，优良菌株漏筛的概率越少。扩大筛选量，是提高育种效率很重要的一个方面。通常诱变一代至少要挑选1000株以上，经平皿预筛后，约保留200株进行摇瓶初筛，这时产物活性测定的工作量还是相当大的。 (1)琼脂平板空洞法

该法是在特制的玻璃框琼脂平板上进行的，以检验菌或底物与一定量的琼脂制成平板，用专制的打孔器取出琼脂块，在留下的圆孔中加入发酵液，或用圆滤纸片浸透发酵液直接覆于琼脂平板上，在适合温度下培养一定时间，测量圆孔或滤纸片周围形成的抑菌圈或水解圈，根据活性团的大小挑选高产菌株。 (2) 纸片法

随着诱变代数的增加，有效产物浓度不断提高，当发酵液中产物浓度相当高时，活性圈大小与产物浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏筛。此时可改用纸片法。具体做法是：取直径0．5cm圆纸片，灭菌后覆于含底物或检菌的琼脂板上，准确取发酵液1—2ul在滤纸片上，置于—定温度下培养20一25h，测量水解圈大小。如果活性圈仍然很大(直径15mm以上)，则可将发酵液稀释，或者增加底物的浓度和琼脂板的厚度，使水解围控制在一定范围内。 5、摇瓶数据的调整和有关菌株特性的观察分析

摇瓶发酵液的测试数据是否准确直接关系到高产菌株筛选频率。一个菌株产量的检测总会存在两种误差，一种是摇瓶培养条件变化影响遗传特性的表达，另一种是检测过程中的误差。虽然严格地控制摇瓶和检测中试验条件，可以使试验误差减少，但无法完全避免。比如，要完成大量菌株的摇瓶培养，在一台摇瓶机上要进行多批试验或同时使用多台摇瓶机试验，在这种情况厂，不同的批次或不同的摇床都会造成系统误差，致使数据之间处于不可比的状态。所以，对摇瓶发酵液的测试数据要尽量应用生物学统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪存真，由此及被，抓住本质，找出其中真正的规律性。

在分离、筛选的整个试验过程中，每个阶段都要周密地观察菌株特性，诱变后分离在平板上的菌落生长情况，如生长快慢、菌落形态、大小、颜色等，要一一详细记录。菌落移入试管斜面后的生长情况、接入到摇瓶种子和发酵培养基后，其培养过程中的糖、氮利用、生长速度、PH变化、颜色、强度等，都要及时观察，结合镜检、测定产物活

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性，进行详细记录。然后综合菌落的形态特征、培养特征及生化特征作为初筛时挑选菌落的依据。另外还要对筛选过程中摇瓶产量数据的分布作全面分析，以便帮助判断诱变剂、诱变剂量及筛选条件的选择是否恰当。如果菌株在初筛时产量数据分布具有明显差异，说明诱变剂、剂量和筛选条件是可行的，若几乎所有菌株都与出发菌株相差无几，则要考虑重新调节和更换诱变剂或筛选条件。摇瓶复筛是经过初筛得到的较优良菌株进一步复证，考察其产量性状的稳定性，从中再淘汰一部分不稳定的、相对产量低的或某些遗传性状不良的菌株。 6、培养基和培养条件的调整

利用单因子法、正交实验法、均匀设计、响应面法等方法进行培养基和培养条件的优化，以充分发挥高产菌株的高产性能。 （八）菌种保藏

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