四川理工学院微生物菌种选育实验指导(2)

（一）稀释涂布法

把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等、样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。 （二）划线分离法

用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌路移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。 （三）利用平皿的生化反应进行分离

这是一类利用特殊的分离培养基对大量混杂微牛物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。 1、透明圈法

在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。

(1) 分离水解酶产生菌

该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选样性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。

(2) 分离产生有机酸的菌株

在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混浊状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。 2、变色圈法

对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。 3、生长圈法

生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围使会形成一个混浊的生长圈。 4、抑菌圈法

常用于抗生素产生菌的分离筛选。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，使会在该菌落周围形

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成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。

（四）通过控制营养和培养条件进行分离

各种微生物对营养要求和培养条件是不同的，在分离筛选时，若在这两个方面加以调节控制，就能获得更好的分离效果。 四、代谢产物鉴别

在目的菌株分离的基础上，进一步通过筛选，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株。某些产生菌在分离时就可结合筛选，一般在平皿上通过与指示剂、显色剂或底物等的生化反应直接定性分离，这种方法本身就包含筛选内容的一部分。但并非所有产生菌都能应用平皿定性方法进行分离，而是需要经过常规生产性能测定，即初筛和复筛方能确定。另外，即使已经通过平皿定性反应分离的菌株也需要进一步筛选和更加精确的定量测定。 （一）初筛

初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。出于菌株多，工作量大，为了提高初筛的效率，通常需要设计一种快速、简便又较为准确的筛选方法。初筛要求筛选的菌株尽可能的多，筛选的菌株越多，就约有希望筛选到所需要的菌株。初筛可以分为两种情况进行： 1、平板筛选

对那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选比来的菌落，即随机挑选的菌株，由于数量很大，又不知是否具有目的产物的生产能力，这时只能首先采取较粗放的检测方法，如平皿快速检测法。 2、摇瓶发酵筛选

由于摇瓶振荡培养法更接近于发酵罐培养的条件，效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广；因此，经过平板定性筛选的菌种可以进行摇瓶培养。一般一个菌株接一个瓶，在一定转速的摇瓶机上及适宜的温度下振荡培养，得到的发酵液过滤后按以下方法进行活性测定：先取玻璃板16cm x 26cm或18cm x 28皿，制备含有鉴定曲(测定抗生家)或底物(两制剂)等的平板。琼脂板厚约3mm，用内径5mm钢圈打孔，取以上过滤后的发酵液10ul逐个加入，放在鉴定菌或酶作用最适温度下温育一定时间，孔的周围出现透明的溶菌圈或水解圈。根据活性圈的大小决定取舍。用该法初步测定发酵液的产物活性时，为避免活性圈较大造成的误差，可用滤纸片代替。在灭过菌的圆滤纸片上调入l一2ul发酵液，温育后测定。苦水解圈仍过大，则可采取稀释发酵液或增加底物浓度或琼脂板厚度的方法，使活性圈的大小有所控制。初筛一株一瓶，取其中10-20%复筛，一株3瓶，直至最后3-5株，广泛考察。 （二）复筛

琼脂平板活性测定法，其最大的优点就是简便、快速，因而在筛选工作量大时具有

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相当的优越件。该法的不足之处是产物活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平，只适用于初筛。通过该法可淘汰85％一90％不符合要求的微生物，剩下较好的菌株则需进行摇瓶培养复筛；这时一个菌株通常要重复3—5个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定。具体做法：把所有摇瓶复筛菌株的发酵液，用琼脂平板法测定一遍(同步重复2—3块板)，将其中活性圈大而清晰的菌株发酵液进一步采用精确检测法测定，选出较优良的菌株2—3株。这种直接从自然界样品中分离出来具有一定生产性能的菌株，称为野生型菌株。

第二节 诱变育种

工业微生物育种过程分为三个阶段：菌种基因型改变；筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株；产量评估，全面考察此变异株在工业化生产上的接受性。简言之，工业微生物育种就是经由改变和操纵微生物的基因，进而选育出适合工业化生产的菌种的一种综合技术。

从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。 一、诱变育种的作用

1、提高有效产物的产量 2、改善菌种特性、提高产品质量 3、简化工艺条件 4、开发新品种

二、诱变育种的试验设计和准备工作

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诱变育种工作包括诱发突变、突变株的筛选和高产变株最佳环境条件的调整。诱发突变包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素。突变株的筛选包括筛选条件(培养基和培养条件)及选择一个简便、快速、有效的筛选方法。环境条件调整是突变株的最佳培养条件改变。以上是决定诱变育种成败的三个方面，在育种开展之前，根据试验目的紧紧围绕三个环节制订试验方案。 （一）了解影响菌种生长发育的主要因素

主要影响有如下几个方面： 1、培养基

2、培养基斜面制备技术 3、移种的密度 4、温度 5、湿度

（二）了解菌株的菌落形态

霉菌、放线菌的菌落形态特征包括：菌落大小、形状、高度、放射线多少、外观组织结构(粉状、绒毛状、絮状等)、孢子多少和色泽、可溶性色素情况等。细菌菌落形态特征包括：菌落大小、形状、边缘结构、高度、颜色、光泽、黏性、表面结构、可溶性色素等。

（三）了解菌种特性及其与生产性能的关系

1、多方面考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。

2、研究菌种的某些生物学特性与产量合成相关性。

3、了解菌种的最佳培养基和培养条件(包括斜面培养基及一、二级发酵培养基)。 （四）建立一个准确、简便、快速检测产物的方法

由于诱发突变频率极低，需要从相当数量的诱变分离菌株中筛选，才有可能移得较理想的突变株。限制筛选量的主要因素，除了摇瓶量之外，检测方法也是重要因素，所以建立一个适应于大规模筛选的有效的检测方法是十分必要的。 （五）研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件

一个优良菌种的获得往往要花费巨大的人力、物力和时间，是非常不容易的，不能随便采用某个培养基、培养条件和保藏方法进行培养和保藏。否则，容易发生回复突变，使菌种特性衰退，优良特性消失，结果将前功尽弃。因此，事先研究一个最佳的培养基、培养条件和适宜的保藏方法是相当重要的。 三、诱变育种的步骤与方法

基本步骤：

原种 （出发菌株） → 纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液

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→诱变处理 → 平板分离 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及扩大试验 （活菌计数） （计数） （变异率）（初筛） （复筛） （再复筛） （一）出发菌株的选择

用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。 1、对出发菌株的要求

生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。 2、出发菌株的选择

(1) 选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异； (2) 选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；

(3) 选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。

另外，出发菌株还可以同时选取2~3株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。

（二）出发菌株的纯化

1、目的：获得遗传性状基本一致的，并且稳定的变种。

2、原因：遗传背景复杂的菌种诱变后负变率将增加；诱变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，又不进行纯化分离，诱变效果差的。 3、纯种分离方法：常用划线分离法和稀释分离法。 （三）同步培养（前培养）

1、目的：获得生理状态一致的培养物。

在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。 2、原因：突变率高，重现性也好。 3、方法：

(1) 细菌一般要求培养至对数生长期；

(2) 霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体。 （四）单细胞(或单孢子)悬液的制备 1、目的

获得单细胞(或单孢子) 、均匀的悬液。 2、原因

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