血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

一、目的

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。

二、原理

带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳：采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维薄膜电泳法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅12μm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋由、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。

三、器材

1．醋酸纤维薄膜（2×8cm） 2．常压电泳仪 3．点样器 4．培养皿 5．粗滤纸 6．玻璃板 7．竹镊

8．白磁反应板 9．新鲜血清

四、试剂

1．巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）

巴比妥2.67g，巴比妥钠15.45g，加水至1000m1。 2．染色液

含氨基黑10B 0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，水40m1。 可反复使用。 3．漂洗液

含甲醇或乙醇45 m1，冰醋酸5ml，水50m1。 4．透明液

含无水乙醇7份，冰醋酸3份。

五、操作

1．浸泡：

用镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别光泽面与元光溶面，并在一角做上记号），放在缓冲液中浸泡20min。

2．点样：

把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后将无光泽重面朝上平铺在玻璃扳上。将点样器放置于白磁反应板中的血清中沾一下，再在膜一端1.5cm处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上细条状的血清样品。掌握点样技术，是获得具

有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。

3．电泳：

如图1.在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽的液面等高，将膜条无光泽面向下平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（滤纸桥是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁）。膜条上点样一端靠近负极。盖严电泳室，通电，调节电压90～100V，电流强度0.4～0.7mA/cm2，通电45～60min，待电泳区带展开2.5～3cm时，关闭电源。

４．染色：

电泳完毕后，将膜条取下放在染色液中浸泡10min。

5．漂洗：

将膜条从染色液中取出后，在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。从正极端起，依次为：清蛋白、α1蛋白、α2球蛋白。β蛋白、γ球蛋白。如图2所示：

定量测定时，可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪下，分别浸在0.4N NaOH溶液中，并剪下相同大小的无色区带，膜条作空白对照，迸行比色；或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3min后贴于洁净玻璃板上，干后，即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。

实验二 酪蛋白的制备

一、目的

学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

二、原理

牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酶蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后，便可得到纯的酪蛋白。

三、器材

1．牛奶 2．离心机 3．抽滤装置

4．精密pH试纸或酸度计 5．电炉 6．烧杯 7．温度计

四、试剂

1．95%乙醇 2．无水乙醚

3. 0.2MpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 A液：0.2M醋酸钠溶液 B液：0.2M醋酸溶液

称有机纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g,定容至1000ml

4.去A液1770ml,B液1230ml混匀，即得pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。 5.乙醇乙醚混合溶液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）

五、操作

1.将100牛奶加热到4℃。边搅拌边缓缓加入预热至40℃的缓冲液，并调节pH之后，冷却至室温。以3000r/min离心10min。弃去上清液，得酪蛋白粗制品。

2.用水洗涤三次，3000r/min离心，弃去上清液。

3.在沉淀中加入乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液沉淀两次，最后再用乙醚沉淀两次，抽干。

4.将沉淀摊开在表面皿上，干燥后得酪蛋白纯品。

5.准确称量后，计算含量，并与理论含量（3.5g/100ml）相比求出实际得率。酪蛋白含量g/100ml：牛乳(g%) 得率=

测得含量?100%

理论含量

实验三 甲醛滴定法测氨基氮

一、目的

初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。

二、原理

水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，可形成—NH—CH20H，—N(CH2－0H)2等羟甲基衍生物，使

＋＋

NH3+放出的H游离出来，这样就可用碱滴定放出的H，测定氨基氮，从而计算出氨基酸的含量。

若样品中只含某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果可算出氨基酸的量。若样品是多种氨基酸的混合物〈如蛋白水解液〉，则滴定结果不能作氨基酸滴定量的依据。一般常用此法测定蛋由质水解程度，水解程度的增加滴定值增大，当水解完全后，滴定值保持平衡。但脯氨酸与甲醛作用生成不稳定化合物，致使滴定结果偏低；脯氨酸的酚基结构又可使滴定结果偏高。

三、器材

1、锥形瓶

2、25 ml碱式滴定管 3、移液管

四、试剂

1．0.5%酚酞酒精溶液

0.5g酚酞溶于100mL60%乙醇中 2．0.05%溴麝香草酚蓝溶液

0.05g溴麝香草酚蓝溶于100mL20%乙醇溶液中 3．1％甘氨酸溶液

1g甘氨酸溶于100rnl蒸馏水

4．标准0.100mol/LNaOH溶液，可采用0.100mol/L标准HCl溶液标定

5．中性甲醛溶液

50ml甲醛溶液，加约3ml0.5%酚酞指示剂，滴加o.1mol/LNaOH溶液，使溶液成微粉红色，临用前配制。

五、操作

取3只锥形瓶，编以1、2、3号。于1、2号瓶中各加甘氨酸溶液2.0ml及水5.0ml； 于3号瓶中加水7.0ml。然后3只锥形瓶中各加入甲醛溶液5.0ml,0.05%溴麝香草酚蓝溶 液两滴及0.5%酚酞酒精溶液4滴。再用标准0.1mol/LNaOH溶液，滴定至紫色(pH0.7-9.0)。则每ml氨基酸溶液中含氨基氮的mg数为：

氨基氮（mg/ml）=

(A?B)?1.4008

2注：A——滴定样品消耗NaOH溶液的ml数

B——滴定空白消耗NaOH溶液的ml数

1.4008——1ml0.1mol/LNaOH溶液相当的氮mg

实验四 氨基酸纸层析法

一、目的

通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。

二、原理

用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的称上行法；由上向下移动的称下行法。将样品点在滤纸上（此点称原点），进行展层，样品中氨基酸在两相中不断迸行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是将氨基酸分离开来。形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。

本实验采用纸层析法分离氨基酸。氨基酸是无色的，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

三、器材

1．氨基酸溶液：缬氨酸、组氨酸、亮氨酸和谷氨酸溶液及它们的混合液，各组分浓度

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