南方医科大学-氨基酸分析-2015级临床医学二-第7实验室(2)

注意事项

1．吸附剂：薄层层析的吸附剂（包括氧化铝和硅胶等）的颗粒大小通常以通过大概200目筛孔为佳，如若颗粒过大，展开时溶剂的推进速率快，则层析效果欠佳。反之，展开过慢，斑点易拖尾，层析效果欠佳。

2．点样：点样次数依样品溶液的浓度确定，样品量过少时，一些组分难以显现，样品量过多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，则分离效果不好，点样后的斑点直径通常以0.2cm为宜。

3．避免污染：层析全过程中，避免以手触碰层析板，必要时戴上手套。 四、结果与讨论：

（一）结果记录：实验图谱如下：

溶剂前沿

A

B

C

混合点1 混合点2 混合点3

起点直线

丙氨酸 甘氨酸 精氨酸 混合氨基酸

实验数据及Rf值计算如下表：

各斑点 样品至起点 溶剂前沿至起点 Rf值 氨基酸名称

丙氨酸 2.42 5.50 0.44 ——

甘氨酸 1.81 5.50 0.33 ——

精氨酸 1.19 5.50 0.22 ——

混合点1 2.27 5.50 0.41 丙氨酸

混合点2 1.80 5.50 0.33 甘氨酸

混合点3 1.15 5.50 0.20 精氨酸

实验现象：

制版：获得白色粘稠状液体，将之均匀涂抹在玻璃板上，在约1小时后凝固，烘干后为白色石灰样固体薄层平板。

点样：做好标记后，分别点样，在点样后点样处因溶液浸润而颜色变暗，干燥之后回复原色。

层析：层析液缓慢向上浸润入层析板，推动在起点线的样品缓慢上移（但该现象因无现象而不被观察到），一个小时后溶液前沿超过层析板的二分之一。

显色：如图所示，可以看到前三列分别有迁移距离不等的三个氨基酸层析斑点显现为紫色，第四列显现出类似紫色的三个色斑。

（二）对结果的讨论

对实验结果的讨论

就混合氨基酸的层析状态分析，如图，层析斑点界限清晰，无拖尾和交叉现象，且溶剂前沿规整（表明固定相涂布均匀），表明实验效果较优。

直观地看，由于特定氨基酸在相同平板层析的迁移率相同，故可简单认为离起点大致相等距离的显色点代表同种氨基酸（A～1；B～2；C～3）。故初步估测该混合氨基酸液中包含：甘氨酸、丙氨酸和精氨酸三种氨基酸。

其次，根据迁移率的计算（结果已在上表显示），可见，混合液中分离出的三个显色点的迁移率分别与标准样的迁移率分别对应大致相等。

综上所述该混合氨基酸成分为甘氨酸、丙氨酸和精氨酸。

操作对结果的影响的讨论

实验过程做的是否恰当直接关系到，实验结果的好坏，为了得到较好结果，我们在过程中做出以下讨论。

调浆：称取硅胶过程中，由于硅胶密度较小，调节好天平后，称量开头宜每次添加较大量硅胶粉末，在添加过程中，为防止因产生扬尘或撒出造成污染，我组的处理方法是药匙由倾斜至竖直，将样品导入天平托盘，而不是侧向导入药品，此种办法可减少上述隐患。带添加至天平轻微晃动，再次取样时用指头轻轻触击药匙柄，使微量药物落入

托盘内，则可防止取样过量。

固定相的均匀度直接影响到层析速率。故加液调浆时，应注意适当匀速向相同方向搅拌，烧杯竖直放立，此种做法可防止过多气泡产生（我组做调浆步骤两次，前一次原因确为因搅拌不当产生较多气泡）

其次倒入玻璃板时，为了使倒板均匀我们采用的办法是，首先在平板中央沿平板长轴一路倾倒完毕（如图绿色线），然后经过倾倒区沿垂直长轴方向来回划动固定相（如图蓝色线），最后将少量为涂抹区补齐，这样能较好地抹匀固定相。（如右图所示）

烘干温度控制在70℃，1h，防止固定相干裂。

点样步骤中，点样次数应适当（1/5管-两次；1/2管-1次），点样次数太少则有的成分不易显示，点样太多则易造成层析斑过大，互相交叉或拖尾，分离效果不佳，点样斑点直径以2mm为宜。点样位置不宜过靠近边缘，否则可能造成层析斑点跑出。

层析过程中，不要让起点线触及层析液，否则样品将被浸脱。

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