南方医科大学-氨基酸分析-2015级临床医学二-第7实验室

生物化学实验报告

姓 名：

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称

氨基酸薄层层析实验

实验地点 指导老师

教师签名

第7实验室 王涵多

实验日期 2016年10月20日 合作者 评分

一、实验目的

批改日期

1、掌握薄层层析法的一般步骤并了解相关原理。

2、掌握氨基酸薄层层析法的基础操作。

3、掌握通过计算迁移率（Rf值）来鉴定混合物的层析分离组分（此处为氨基酸混合液）。

二、实验原理

1、薄层层析的原理

薄层层析一般将固定相（固体吸附剂）涂布在固体上形成薄层进行层析的方法。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于，点在薄板上的混合氨基酸样品随展开剂移动的速率因各氨基酸在展开溶剂中的溶解度相异而不同，而后者表现的差异取决于吸附剂对不同氨基酸的吸附力，继而，不同组分可两两分离。此即以吸附-解吸-再吸附-再解吸机制反复进行分离样品各组分。

本实验固定相支持物是硅胶，黏合剂是羧甲基纤维素钠，展开剂则为冰醋酸、正丁醇和水的混合物。通过测定Rf值来鉴定分离后的混合氨基酸的组分。

2、氨基酸与茚三酮的显色反应

茚三酮水化后生成的水合茚三酮，该物质与氨基酸可通过羧基反应产生还原茚三酮和氨基醛，还原茚三酮和氨基茚三酮共热缩合生成蓝色化合物，氨基酸层析斑点即显色。

3、基于相对迁移率Rf值判定混合氨基酸组分

层析中，物质沿溶剂运动方向移动的距离与溶液前沿距起点的距离之比为Rf值，即：

Rf=原点至层析斑中心的距离/原点到层析斑对应前沿的距离

由于物质在相同溶剂中具有确定的分配系数，故相应的迁移率（Rf值）亦为确定值，因此可依据Rf值鉴别层析分离的物质。

三、材料与方法：

（一）材料

①0.01/molL 丙氨酸；

②0.01/molL精氨酸；

③0.01/molL甘氨酸；

④混合氨基酸溶液

试剂

1．硅胶

2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）

3．展开溶剂

4．0.1%茚三酮溶液

5．展层-显色剂

仪器和器材

①层析板（6cm×15cm） ②小烧杯

③量筒（10ml） ④小尺子

⑤毛细玻璃管 ⑥层析缸 ⑦烘箱

试验流程

制板→点样→层析→显色

（三）具体步骤（请见下一页）

（1）调浆：将称得的3g硅胶和量取得0.5%的羧甲基纤维素钠8ml调制成均匀糊 状。 （2）涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层上述匀浆。 （3）干燥：水平摆放玻璃板，室温下静置0.5h：自然晾干。 （1）标记：用铅笔距底边2cm水平线等距标注4个点并标识名称。各样品间距10mm。 （2）点样：用毛细管分别吸取甘氨酸、丙氨酸、精氨酸及混合氨基酸溶液，轻触平板表面以点样。加样原点扩散直径不超过2mm。后用恒温烤箱70℃烘干。 确保展层-显色剂液面低于点样线后浸薄层板点样端入展层-显色剂并盖好层析缸盖，待展层上行。当展层剂前沿超过3/5玻璃板时，停止展层后取出玻璃板后铅笔描出溶剂前沿线。 在70℃下烘干20min，即可显出各层斑点。

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