细胞实验讲义

实验一 光学显微镜的使用及显微绘图（3课时）

实验目的

在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。 实验原理

细胞在形态上是多种多样的，有球形、椭圆形、扁平形、立方形、梭形、星形等。虽然细胞的形状各异，但是它们却有共同的基本结构特点，都由细胞膜（动物）、细胞壁（植物）、细胞质和细胞核组成。细胞中的各种细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等，一般经过一定固定染色处理后，大多数在光学显微镜下是可以看见的（图3-1）。细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别。

图 3-1 细 胞 形 态 结 构

a. 柿胚乳细胞示胞间连丝；b. 马蛔虫受精卵分裂中期示中心粒 ；c. 兔的神经细胞中高尔基体；d.小鼠肝细胞线粒体

实验仪器、材料和试剂

1．仪器：复式显微镜、擦镜纸

2．材料：洋葱根尖切片、柿胚乳细胞、小白鼠肝切片、动物细胞中的DNA、马蛔虫受精卵切片

3．香柏油或石蜡油、二甲苯 方法与步骤

一、洋葱根尖切片细胞的观察

先用低倍镜观察根尖的纵切面，注意分生区、伸长区、成熟区细胞的异同，然后再仔细观察细胞的形态结构，特别注意细胞的形状、大小，以及细胞壁、细胞核、核仁、细胞质、液泡的形态结构。

二、柿胚乳细胞示胞间连丝的观察

先在低倍镜下找到柿胚乳细胞，然后转用高倍镜观察，可看到细胞间丝状的联系。 三、小白鼠肝细胞切片糖原的观察

先用低倍镜后用高倍镜观察，可见到许多肝小叶，每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞，细胞中央有大而圆的细胞核。这时，转用油镜观察，可见到细胞质内分布着许多被染成深色的糖原颗粒。

四、马蛔虫受精卵切片中心体的观察

取马蛔虫受精卵切片，在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵，每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜，膜内有宽大的围卵腔，各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞。找到分裂中期的细胞，在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一个

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较小的，亦被染成蓝色的小粒，称中心粒。在中心粒的周围可见呈放射状的星丝。 （五）动物细胞中的DNA

先用低倍镜找到动物细胞后，用高倍镜观察，可见到细胞中央被染成深色的细胞核。

【作 业】

1．画出洋葱根尖细胞图，并标示出细胞的各部分。

2．画出柿胚乳细胞胞间连丝图，并标示出细胞的各部分。 3．画出小白鼠肝细胞糖原图，并标示出细胞的各部分。

4．画出马蛔虫受精卵细胞中心粒图，并标示出细胞的各部分。 5. 画出动物细胞中DNA图，并标示细胞的各部分。

实验二细胞膜的通透性观察 （3课时）

一、实验目的

1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。 2.了解溶血现象及其发生机制。 Ⅰ 观察植物细胞的质壁分离与复原 质壁分离原理

当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的伸缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁逐渐分离开来，也就是逐渐发生了质壁分离。反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。

实验材料

紫色洋葱的鳞片叶、质量浓度为30%、50%的蔗糖溶液、蒸馏水，5%的硝酸钾、碳酸氨溶液，2.5%、10%的氯化钠溶液。０.０３％的中性红色溶液

实验用具

刀片、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜. 实验步骤

预备：用小刀在鳞片内侧划成约２×２ｃｍ的小块，将取下的小块放入０.０３％的中性红色溶液中染色１０～１５ｍｉｎ。取出小块稍加冲洗后，两手握住处理过的鳞片两侧并朝内表皮方向对折。即可露出带红色的薄膜内表皮。

1.制作临时装片 (选材、取表皮、制片) 2.观察（先低倍镜观察然后高倍镜观察） 3.引流法加入30％的糖液（重复数次） 4.静置、观察

5.引流法加入清水（重复数次） 6.静置、观察

7.同样的步骤用50%蔗糖、蒸馏水、5%的硝酸钾、碳酸氨溶液，2.5% 、10%的氯化钠溶液重复一遍。

Ⅱ 溶血的观察 实验原理

细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透

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作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

实验用品

（一）材料 鸡血细胞

（二）器材 普通显微镜、普通离心机、扭力天平、10ml 试管、10ml 刻度离心管、试管架，2ml 注射器（无需针头）或5ml 移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。

（三）试剂

1．Alsever 溶液 葡萄糖 2.05g

柠檬酸钠(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g 柠檬酸（C6H6O7.H2O） 0.05g 氯化钠 0.42g 蒸馏水 100ml

调PH 至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4℃冰箱保存。 2. 0.128 mol/L NaCl 溶液。 3．0.05 mol/L NaCl 溶液。 4．0.4 mol/L NaCl 溶液。 3. 0.128 mol/L NH4Cl 溶液。 4. 0.128 mol/L NH4AC 溶液。 5. 0.128 mol/L NaNO3溶液。 7. 0.32 mol/L 葡萄糖。 8. 0.32 mol/L 甘油。 9. 0.32 mol/L 乙醇。 10. 0.32 mol/L 丙酮。 11. 蒸馏水。 实验步骤：

1．从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever’s 液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2 周内使用）。

2. 使用前，取用Alsever’s 液保存的新鲜鸡血5ml ， 加入8ml 的0.128 mol/L 的NaCl 溶液，小心混匀，1000 r/min 离心5min，如此3 次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。

3. 取11 支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。

观察结果 ：

1. 试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。

2. 如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片。

3. 如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。 实验建议

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1. 鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。

2. 目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液； 3. 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。 目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－

作业：

1. 以表格记录各种溶液的溶血现象观察结果

2. 就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析。

实验三 液泡系的超活染色与观察 （3课时）

实验目的：观察动植物活细胞内液泡系的形态、数量与分布；学习一些细胞器的超活染色技术。

实验原理：活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。中性红(neutral red)这种弱碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于液泡系的染色具有专一性。只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中的某些蛋白质有关。

实验仪器设备：显微镜，擦镜纸，刀片，镊子，载玻片和盖玻片，吸水纸若干。 实验试剂：

1、Ringer溶液 300ml：NaCl 2.55g ；KCl 0.75g ；CaCl2 0.09g ；蒸馏水定容至300ml 2、0.03%中性红溶液 100 ml：0.03g中性红溶于100 ml Ringer溶液中，棕色瓶保存 实验材料：小麦种子或黄豆幼根根尖 实验步骤：

液泡系的超活染色与观察

1、实验前，把小麦种子或黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽到1cm以上 2、取清洁载玻片，滴2滴0.03%中性红溶液

3、用刀片将出生的幼根根尖切一纵切面，放入染液中 4、3染色10-15分钟，注意不可使染料干燥

5、吸去染液，滴1滴Ringer液，加上盖片，轻轻敲击，使根尖压扁 6、低倍镜检，油镜观察 作业：

1、绘小麦或黄豆根尖细胞示液泡系形态与分布。

实验四 叶绿体的制备及其对染料的还原（3课时）

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实验目的：

掌握分离与纯化叶绿体的方法，了解细胞器的一般分离程序及叶绿体的光还原活性。 实验原理：

细胞或组织和分离介质混匀，经破碎匀浆后用差速离心法，经几次不同转速可以获得 不同的细胞器。离体的完整具有光合活性的叶绿体的制备就是采用这种方法。

被分离的离替叶绿体是否具有光合活性，可以用不同的方法来鉴定，对染料（2-6— 二氯苯酊酚）在光下还原作用是其中的一个方法。

光e- ↓

H2O + 氧化型染料（兰色）→→ O2 + 还原型染料（无色）

所以我们通过染料和离体叶绿体混合液在照明光前后，染料颜色上变化可以鉴别被分离的叶绿体的活力。

叶绿体是比较大的细胞器，在叶肉细胞中含量丰富，用新鲜的植物叶片匀浆后使用普通离心机进行离心也能得到良好的分离效果。

叶绿体酶系对热敏感，在室温下容易失活，因此，提取叶绿体全部过程必须保持在冷的条件下。这样在实验中所需的基本仪器和药品都必须保存在冰箱中，而且整个操作过程都应在0-4℃条件下完成。

仪器设备和材料：

显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、离心机、瓷研体、盘式天平、剪刀、纱布、玻璃漏斗、烧杯、量筒、玻璃棒、滴管、吸水纸、分光光度计、水浴锅、新鲜的菠菜叶。

试剂及配制：

[1].STN 缓冲液：0.4M 蔗糖，0.01M NaCl, 0.005M MgCl2, 0.05M 溶解于三羟甲基胺基甲烷（Tris）—HCl 缓冲液，调pH 到7.6。

称取6.06gTriS，136.9g 蔗糖，0.58gNaCl，0.29gMgCl2 加入蒸馏水750ml 混合后用1N HCl 调节pH 至7.6，然后用蒸馏水稀释到1L。

[2].1×10-4 M ３-(3,4-二氯苯)-1，1 二甲基脲（DCMU）。 [3].2.5×10-4 M 2.6-二氯苯酊酚，：称取二氯苯酊酚72mg，溶解于1L 蒸馏水中，在黑暗条件下保存。

[4].冰块 实验步骤：

（一）叶绿体的制备。

1、菠菜叶片洗净吸干表面水滴，贮在4℃冰箱中备用。 2、取10ml 分离介质（STN 缓冲液）分两次放入研钵中。

3、去掉叶柄和主脉，称取5 克叶片并把叶片剪称1－2cm2 小块和介质一起在钵中研磨， 研磨成匀浆为止。

4、将匀浆用二层纱布过滤到烧杯中。

5、滤液用1000rpm 离心8 分钟，弃去沉淀，留上清。

6、上清液中加入介质5ml，混匀，再以1000rpm 离心8 分钟，弃去沉淀，留上清。 7、上清液用2500rpm 离心10-20 分钟，弃上清液，留下沉淀的叶绿体小球。

8、加入适量冷却的STN 缓冲液，将沉淀的叶绿体全部悬浮，将叶绿体悬浮液一起贮存于冰箱中。

9、转移出0.5ml 叶绿体悬浮液到另一只干净试管中，在60℃水浴中保持5 分钟，然后取出试管，贴上标签再贮存于冰箱中。

10、分别在两张载片上各滴一滴加热和未加热的叶绿体悬浮液，并用盖片盖起来，在油镜

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