药物SRB法实验步骤

药物SRB法实验步骤(根据原方案)

SRB（黄酰罗丹明B）比色分析

1.1%乙酸：量取2ml乙酸，定容到200ml。4℃保存 2.0.4%SRB

200ML：称取0.8gSRB，溶于200ml乙酸中。室温保存。 3.1 %TCA（三氯乙酸MV163.39）

250ML:称取2.5gTCA加水定容至250ml，4℃棕色瓶或锡纸避光保存。 4．50%TCA

100ml ：称取50gTCA，加入水定容至100ml。4℃棕色瓶或锡纸避光保存 5.10mM unbuffered Trisbase(PH10.5)

500ML:称取0.6057g Trisbase（三羟甲基氨基甲烷MV121.14）加水定容至500ml4℃保存

1青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚的配制

青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚采用DMSO溶解，使用终浓度皆为0、3、10、30、100、300μg/ml。阴性对照为1%的DMSO溶液。

青蒿素 55mg/400ul 137.5μg/ ul 分子量：282.33 蒿甲醚 51mg/600ul 83.33 μg/ ul 分子量：298.37 双氢青蒿素 30mg/ml 30μg/ ul 分子量：284.35 青蒿琥酯 120Mm 46.13μg/ ul 分子量：384.42 青蒿琥酯 50mg/200ul 250μg/ ul 将每种药稀释成30μg/ ul： a． 取30ul 137.5μg/ ul的青蒿素，加107.5ul的DMSO b．取30ul 83.33 μg/ ul的蒿甲醚，加53.33ul的DMSO c． 取30ul 46.13 μg/ ul的青蒿琥酯，加16.13ul的DMSO

药物终浓度（μg/ ul） 0 3 10 30 100 每孔药物体积（ul） 0 0.02 0.0667 0.2 0.667 5孔药物体积（ul） 0 0.1 0.333 1 3.33 补的DMSO体积(ul) 10 9.9 9.667 9 6.67 备注：上述的药物为稀释成30μg/ ul的药物。

取12个EP管，每个加入（200ul*5）的应用液，按上述表格加入对应的药物和DMSO

⒉ 接种细胞

细胞传代至对数生长期后，经胰酶-EDTA液消化，调终浓度为5×10 4 /ml，接种于96孔板中，每孔200μl。，（边缘孔用无菌PBS填充），5%CO2，37℃孵育。

⒊ 培养细胞

24h后（至细胞单层铺满孔底（96孔平底板））, 弃去板上各孔内原有液体，再分别换上含有相应浓度药物的细胞培养液，于37℃，5%CO 2 培养箱中培养;

300 2 10 0

各种药物每浓度设5个平行孔。

⒉ SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束（48h）后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定；加TCA时必须轻轻加在培养液表面，先静置5 min然后再将平板移至4℃放置1 h，这样细胞固定在培养孔的底部。

⒊ 倒掉固定液，小孔用灭菌三蒸水洗5遍，甩干，空气干燥。

⒋ 每孔加入0.4% SRB溶液100μl，避光，在室温放置10 min。未与蛋白结合的SRB用1% TCA液洗5遍，空气干燥。

⒌ 结合的SRB用150ul 10 mmol/l非缓冲Tris碱液（pH10.5）溶解，放在微量振荡器上5 min，避光。

⒍ 在酶联免疫检测仪测定OD值，用空白对照调零，在波长为490 nm处测定每个小孔的OD值。将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体外抑制率。

抑制率=（无药细胞对照孔OD值-用药孔OD值）/无药细胞对照孔OD值×100%

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