浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究

酿 酒

HQUOR MAKING V01．30．No．2 Mar．， 2OO3

文章编号：1002—8110(2003)02—0018一o4

浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究 王耀 ，范文来 ，徐岩2，刁亚琴 ，陆红珍

(1．江苏洋河集团有限公司，江苏宿迁223725；2．江南大学生物i程学院，江苏无锡214036) 摘要：对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反应体系来代替传统方法的水相反应，与传

统测定方法(需反应100h)相比，它能简单、快捷检测大曲质量，适合工业化生产的要求。有机相中酯化反应

条件为：在30mL正庚烷有机反应介质中，35 的条件下，0．15M的底物酸，己酸与乙醇的浓度比为1：1．25，加

入15g(干曲)的大曲，仅用24h就能比较出大曲酯化力的高低。 关键词：浓香型，大曲，酯化酶，酯化，测定方法 中图分类号：TS262．31；TQ925 文献标识码：A ‘ 0 前言

酯酶(Eaemse E．C．3．1．1．2)亦称羧基酯酶，是指可以水 解羧酯键的酶【lI4J。但该酶也能催化合成低级脂肪酸

酯Ll J。由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因 此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[5-7 J。酵母、霉 菌、细菌中均含有酯酶[ ，6． 。目前已经发现，红曲霉、根霉中 许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力【5' 。

酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶(缉磁e，E．C．3，1．1，3)是一

类特殊的酯酶，全称Tr／acy／g／ycerd acy／hydro／aseo脂肪酶的正 式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘 油，又能催化脂肪的合成【5．9J。按Novo Nordisk公司的定义， 脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类— —三羧酸甘油酯的酶， 而酯酶则是可以水解羧酯键的酶【111。

对大曲酯化力的研究开始于20世纪8o年代后期[12,13J， 但广泛和深入的阐述大曲对浓香型酒生香的作用却是在20 世纪90年代[ 一 ·M一 刮。

传统的酯化力测定方法【6J，是利用皂化反应和反滴定法 来测定。此法测定时间长，操作复杂。本文研究了利用有机 相代替水相的酯化酶活力的测定。

0．1 传统酯化力的测定【6J 6

先用碱中和酯化液中的游离酸，再加入一定量的碱使酯 皂化，过量的碱用酸进行反滴定，用酚酞作为指示剂。其反 应式为：

RC00H +NaOH— ÷ RC00Na+ROH

2NaOH+ Sq— 一Na2S04+2H20

0，2 优化后酯化力测定方法的原理

近年来，酶在有机相中的生物催化作用因其潜在的工业 用途而日益受到人们的重视[117,18】。与水相催化相比，有机 介质可以增加酯酶的热稳定性，增加非极性底物的溶解度， 减少反应副产物，还可能影响酶的底物特异性及酶反应的平 收稿日期：2o03—01—16

衡方向和反应速度。有机溶剂相中酯化反应平衡点与速率 同溶剂中水含量密切相关，有机溶剂作为反应介质时，在一 个狭窄的初始含水量范围内，酶有较高的催化酯化活力。当 初始加水量较低时，酶分子由于不能获得形成活力构象所必 需的水，表现出较低的催化反应活力；当体系中水初始含量 高时，从物理状态来看，在反应的初始阶段酶粉即发生粘结， 产生吸附现象，无法均匀分散，故反应速率也降低。对本研 究而言，所加入的酶不是纯酯化酶，而是加入一定量的带水 分的大曲，大曲含水量在12％左右，此时反应体系中的含水 百分比约为6％左右，这虽然高于一般反应介质的最佳含水 量【181，但仍处于微水范围。而且，反应所利用的酯化酶是从 大曲颗粒里浸出来的，酶量很少，加上曲粉的间隔作用，这样 的含水量是不会发生酶粘结现象的，因此采用无水有机溶剂 与试剂进行酯化力的测定方法是可行的。

现以正庚烷为有机溶剂来代替水相进行酯化力测定方

法的优化，以期在尽可能短的时间内鉴别出大曲酯化能力的 高低。由于大曲的酯化反应是可逆反应，因此不仅要优化条 件以确保酯化能力最强，同时还要确保在此条件下分解能力 最差，只有酯剩余量多的条件才是最适条件。 1 试验材料

1．1 大曲 1．1．1 粉碎

用微型植物粉碎机粉碎。筛孔~'lmm。 1．1．2 分样

采用四分法。通常样品需要量500 引。 1．1，3 大曲样品分类方法 见参考文献[23】。

1．2 试剂

1．2．1 正庚烷，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入3og无水硫酸 钠。

1．2，2 己酸，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入30g无水硫酸钠。 1．2．3 无水乙醇，AR级，每瓶试剂( )加入30g无水硫 酸钠。

1．2．4 pH4，6醋酸一醋酸钠缓冲液，配制方法见参考文 献【6J。

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第2期 王耀，等：浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究 ·l9 ·

1．2．5 100m~100mL己酸乙酯的20％(v／v)乙醇溶液，配制 方法见参考文献 。 1．3 仪器

恒温培养箱：上海恒三仪器厂。 2 测定方法

2．1 传统酯化力的测定方法具体见文献【6J。 2．2 优化后酯化力测定方法

影响己酸乙酯合成反应的因素有很多，做单因素分析实 验，对加入底物酸(己酸)与乙醇的浓度、加曲量和反应温度 等进行优化。每间隔一段反应时间，取出上清液0．2mL于 50mL三角瓶中，加入5mL水，1滴酚酞，用O．025MNaOH滴定 至酚酞终点，记下消耗的毫升数。计算公式为： 降酸％ =(Vl—Vo)×100％vo

式中：v0一反应前消耗NaOH的体积(mL) vl—— 反应一段时间后消耗NaOH的体积(mL) 3 结果与讨论

3．1 酯化力

3．1．1 传统方法测定酯化力

传统方法采用100mL 1％的己酸、乙醇溶液，加相当于5g 干曲的曲量，在30—32℃ 酯化100h，用NaOH皂化己酸乙酯 来求得己酸乙酯量。下面对1 、2 曲及陈曲的酯化力进行 测量，以便进行优化的研究(表2)。 表2 传统方法测定酯化力(三次平均)

从表2可以看出，大曲的质量越好，酯化力越高；贮存时 间短的曲(三个月以上)，酯化力越大，但陈曲的酯化力不高。 因此，仅从酯化力考虑，大曲的贮存时间也不可过长，否则， 酯化力会大幅度下降。

3．1．2 优化方法的建立

影响酶在有机溶剂中催化合成己酸乙酯反应的因素 有 ．2 】：第一，底物浓度比(酸、醇浓度比)。第二，加酶量。 加酶量有一个临界值，当加酶量小于临界值时，会影响反应 平衡转化率；当加酶量超过临界值后，平衡转化率不再发生 变化，而反应速度随着酶量的增加而加快。第三，底物的浓 度、尤其是有着较强极性的己酸浓度，直接关系着酶的催化 活性和稳定性。第四，反应温度。它既关系着酶的活性，也 关系着反应速度。第五，有机相中，酶的催化活性与反应系 统的含水量密切相关，只有最适含水量时，酶最稳定，且表现 出最大活力。

3．1．2．1 底物酸与醇的比例对酯化反应的影响

理论上，己酸与乙醇反应的摩尔比为1：1，为使反应向己 酸乙酯方向顺利进行，醇应略过量。设定乙醇的三个梯度。 定量：正庚烷30mL，己酸0．15tool，绝干曲量5g，温度 30℃ ，在100mL磨口三角瓶中反应。

变量(摩尔比)：己酸：乙醇=1：1．15(样品一) 己酸：

乙醇=1：1．25(样品二) 己酸：乙醇=1：1．35(样品三) 螽 逝

0 50 100 150h + 样一 + 样二 + 样三

图1 底物酸与醇比例对鸶化的影响

由图1知：样品二的降酸幅度大于样品一和样品三，说 明样品二比样品一、样品三早达到平衡点，所以取底物酸与 醇比例为1：1．25。

3．1．2．2 加曲量对酯反应的影响

定量：正庚烷30mL，己酸-乙醇=1：1．25，己酸浓度 0．15mol，温度30℃ ，在100mL磨口三角瓶中反应。 变量：加曲量分别为5g、10g、15g(若加入20g大曲则会没 有溶剂剩余)。

由图2可知：最佳加曲量为15g。 蕊 世

反应时间(x10 )

图2 加曲量对酯化的影响

3．1．2．3 底物酸浓度对酯化反应的影响

资料表明【培J，当基质中己酸含量在50×10一 以下时，己 酸乙酯按比例增加，在(50—70)×10I6之间，己酸乙酯虽有增 加，但升幅较大。

3．1．2．3．1 设定己酸浓度梯度为0．1—1．0mol，确定最佳底 物酸浓度。

定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1：1．25，干曲量15g，温 度30℃ ，在100mL磨口三角瓶中反应。

变量：己酸浓度分别为0．1n 、0．2mol、0．4mol、0．6mol、 0．8mol、1．0mol。

图3说明底物酸浓度太高时，便抑制反应向己酸乙酯方 向进行，0．1mol浓度时降酸最快。

3．1．2．3．2 设定己酸浓度在0．1—0．2tool之间。 定量：同上。

变量：己酸浓度分别为0．1tool、0．125mol、0．15mol、 0．175mol，作图4。

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澄20 10 0 螽 澄

0 50 100h

己酸降酸曲线

圈3 己酸浓度对酯化的影响 — ●一0．1M ．- II-0． + 0．4M * 0．6M 0．8M + 1．oM

圈4 底物酸浓度对酯化的影响

由图4可以看出0．1mol与0．2mol间的降酸曲线斜率差 距不大。0．15tool的降酸稍微快一点，所以优化后所得的己 酸浓度为0．15tool。

3．1．2．4 温度对酯化反应的影响

资料表明，在低温25—30℃ 时，生成总酯量高。随着温 度上升，总酯量明显下降。酿造过程中，曲霉与酵母对己酸 都有不同程度酯化能力。当酵母与曲霉两者共同作用时，则 己酸乙酯量大增。产酯酵母主要是球拟酵母，35℃时产酯量 最高，曲霉作用温度也在35℃左右。于是作三个温度梯度， 以期找到最佳温度。

定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1-1．25，己酸浓度 0．15M，干曲量15g，在100mL磨121三角瓶中反应。 变量：酯化反应温度为25℃ 、30℃ 、35℃。如图5。 0 50 100h

圈5 温度对酯化反应的影响 + 25℃ + 30℃

+ 35℃

由图5可以看出，35℃ 时反应最快，因此选用的酯化反 应的温度为35℃。

3．1．2．5 酯化反应最佳条件

综上所述，优化后最终的酯化反应条件为：在30mL正庚 烷有机反应介质中，加入底物酸与乙醇，底物酸的浓度为

0．15mol，己酸与乙醇的浓度比为l：1．25，加入大曲15g，在 100mL的磨口三角瓶中，35℃的条件下反应。 3．1．3 优化后的方法与传统方法对比

优化以后的测定与传统方法相比具有很大优点，主要体 现在以下几个方面(见表3) 表3 优化前后方法的对比

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