微生物学综合实验(09)

综合性实验

实验一、噬菌体的分离和纯化及效价测定

病毒是一类个体极小的超显微生物,必须借助电子显微镜才能观察到。病毒没有细胞结构，大多数病毒是蛋白质与核酸组成的大分子，每种病毒的核酸或是RNA或是DNA。它们是专性寄生物，不能独立进行代谢活动与繁殖，只能在特异的宿主细胞内进行复制。根据宿主的不同，可将病毒分为动物病毒(包括昆虫病毒)、植物病毒与细菌病毒——噬菌体等。由于病毒是专性寄生物，因此还不能用人工培养基进行培养，对病毒的培养与测定主要依靠实验性感染，例如细菌病毒(噬菌体)需要对特异性细菌进行感染：植物病毒进行实验性植物感染，而动物病毒常用鸡胚培养和组织培养来代替动物的实验性感染：昆虫病毒则用昆虫感染或组织培养。

一、实验目的

1、学习噬菌体分离、纯化的基本原理和方法。 2、观察噬菌斑，学习噬菌体效价测定的基本方法。

二、基本原理

因为噬菌体是专性寄生物，某种噬菌体往往只能感染一种或与它相近的某种细菌，其分布一般取决于宿主细菌的分布，所以自然界中凡有细菌的地方，均可发现其特异的噬菌体的存在。例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，在其中能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体：乳牛场有较多的乳酸杆菌，容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。虽然近年的研究表明，自由噬菌体颗粒可以在环境中短期独立存活，对自然条件有一定的耐受能力，又受到自然流动的散布，不一定总是和其宿主细菌同时存在，但没有宿主细菌的地方，其特异噬菌体的数量比较少。

大多数烈性噬菌体DNA (或RNA)侵入细菌细胞后迅速进行复制、转录和系列基因的表达并装配成噬菌体颗粒，通过裂解宿主细胞或通过\挤出\宿主细胞(宿主细胞不被杀死，如M I3噬菌体)而释放出来，可使混浊的菌悬液变为澄清或比较清，此现象可指示有噬菌体存在。也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而分离到特异的

噬自体。在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被感染细菌的生长从而形成透明的或混浊的空斑，称噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体效价。

噬菌体的效价就是1m1养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，因此能迸行噬菌体的计数。但困噬菌斑计数方法实际效率一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位〈plague-forming units，简写成pfu)表示。

本实验是从不同环境中分离原核微生物的噬菌体，然后进一步纯化，并对纯化后的微生物裂解液进行噬菌体效价的测定。 三、材料与仪器

1.菌株（实验室中现有菌株自选）：选1株 2.培养基：

500ml三角烧瓶内装3倍浓缩的细胞微生物培养基100m1，试管液体养基，上层琼脂培养基(含琼脂0.7%，试管分装，每管4ml)，底层琼脂平板(含培养基10m1，琼脂2%)。 3.仪器及其他用具：

灭菌玻璃涂棒，灭菌吸管，无菌滤器(孔径0.22μm)，恒温水浴箱，真空泵等。

4.噬菌体分离源：阴沟污水，自然海水等（视宿主菌而定） 四、操作步骤 1.噬菌体的分离 (1)制备菌悬液：

(2)增殖培养。在l00m1 3倍浓缩的液体培养基的三角烧瓶中，加入噬菌体分离源水样品200ml与宿主菌悬液2m1，37℃振荡培养12~24h。 (3)制备裂解液。将以上混合培养液2500r/min离心15min。

将无菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，规操作连接真空抽滤装置。将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液经37℃培养过夜，作无菌检查。液体抽滤完毕，应打开安全瓶的放气阀增压后再停真空泵，否则将

产生滤液回流，污染真空泵。

(4)确证试验。经无菌检查没有宿主菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在。 于琼脂平板上加一滴细菌悬液，再用涂棒将菌液涂布均匀。

待平板上菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，置37℃培养过夜。如果在滴加滤液处形成透明噬菌斑，便证明滤液中有宿主菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化

(1)如己证明确有噬菌体存在，则用接种环取滤液一环接种于液体培养基内，再加入0.1ml宿主菌悬液，混匀。

(2)取上层琼脂培养基，融化并冷却至48℃(可预先融化、冷却，放48℃水浴箱内备用)，加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2m1,立即混匀。 (3)立即倒入底层琼脂平板上，铺匀。置37℃培养24h。

(4)此法分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，需要进一步纯化。噬菌体纯化的操作比较简单，通常采用接种针(或无菌牙签)在单个噬菌斑中刺一下；小心采取噬菌体，接入含有宿主菌的液体培养基内，37℃培养。 (5)待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。 3.高效价噬菌体的制备

刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按1:10的比例混合，再加入宿主菌悬液适量(可与噬菌体滤液等量或1/2的量),培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的噬菌体制品。 4.噬菌体效价的测定

(1)将4管含0.9ml液体培养基的试管分别标写10-3，10-4，10-5和10-6。 (2)用1m1无菌吸管吸分离纯化培养的10-2宿主菌噬菌体0.1ml，注入10-3的试管中，旋摇试管进行混匀。

(3)用另一支无菌吸管从103管中吸0.1ml加入10-4管中，混匀，余类推，稀释至104管。

(4)将5支灭菌空试管分别标写10-4，10-5， 10-6和10-7和对照。

(5)用吸管从10-3噬菌体稀释管吸0.1ml加入10-4的空试管内，用另一支吸管从104稀释管内吸0.1ml加入10-5空试管内,直至10-7管。

(6)将宿主菌培养液摇匀，用吸管取菌液0.9ml加入对照试管内，再吸0.9ml加入10-7管，如此从最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9ml宿主菌培养液。 (7)将以上试管旋摇混匀。

(8)将5管上层培养基融化，标写10-4，10-5， 10-6、10-7和对照。冷却至48℃，并放入48℃水浴箱内。

(9)分别将4管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合后,立即旋摇混匀。

(10)将旋摇均匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板。 (11)凝固后,置37℃培养。 (12)观察记录。

观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑形成单位(pal)记录于实验报告表格内，并选取30~300个ph数的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体效价。 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数×10 五、实验报告 1.结果

(1)绘图表示平板上出现的噬菌斑。

(2)记录平板中每稀释度的ph数于下表中,并计算所得噬菌体的效价。

噬菌体稀释度 10-4 10-5 10-6 10-7 对照 pfu数 2.思考题

(1)能否用伤寒杆菌(肠道菌)悬液作为宿主细胞分离大肠杆菌(肠道菌)的噬茵体，为什么?

(2)试比较分离纯化噬菌体与分离纯化细菌、放线菌等在基本原理和具体方法上的异同。

(3)新分离到的噬茵体滤液要证实确有噬菌体存在，除本实验用的平板法观察噬茵斑的存在以外，还可用什么方法？如何证明？

(4)如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？

(5)什么因素决定噬茵斑的大小？

六、注意事项

·加宿主菌增殖的污水裂解液一定要过滤除菌，不过滤的污水会因为还含有其他细菌的存在，而这些细菌不能作为宿主菌噬菌体的宿主，将会在平板上生长出正常的菌落,有可能观察不到噬菌斑。

·噬菌体纯化的关键是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌试验时，先做预备试验，若平板上的噬菌斑连成一片，则需减少接种量(少于一环)或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。

·在计算噬菌体效价时，要注意控制稀释度，一般选择30-300个pfu的平板计数较好，pfu太少误差比较大；太多则有可能相连，影响计数。 七、参考文献

[1]祖若夫,胡宝龙,周德庆.微生物学实验教程.上海:复旦大学出版社,1993. [2]黄秀梨.微生物学实验指导.北京:高等教育出版社,1999. [3]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验.北京:高等教育出版社,1999.

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