响应面法优化疏螺旋体素发酵培养基(5)

摘要：微生物在医药、能源、精细化工等工业生产过程中发挥着重要的作用，然而其应用过程中有机溶剂的存在会严重破坏微生物细胞的生理功能。因此，提高微生物细胞的有机溶剂耐受性及其耐受性机制研究，对微生物菌株在生物催化和生物燃料等产业应用中具有重要的意义。研究室通过全局转录机制工程结合高通量筛选[1,2]获得一株能够耐受2%（v/v）丁醇的突变株，并利用基因芯片进行转录组学分析。芯片结果显示：329个差异表达基因被鉴定（包括197个上调基因和 132个下调基因) (P＜0.05; FC≥2)。这些差异表达基因所编码的蛋白主要参与碳代谢，能量代谢，氧化压力应答，信号转导通路等生物过程。为了验证差异表达基因与溶剂耐受性的关系，选择了转录水平差异显著的上下调基因进一步研究 [3]。结果显示上调基因gcl、glcG、tdcD等的过表达能够明显提高大肠杆菌对丁醇的耐受性，下调基因yibT、yghW等的敲除使大肠杆菌对丁醇的耐受性也有所改善。gcl编码乙醛酸醛连接酶参与乙醛酸循环（TCA循环支路），检测显示代谢中间物丙酮酸水平显著提高，推测该基因的上调有利于提高细胞内能量水平，这正是细胞应对溶剂压力的调控方式之一。yibT、yghW编码的两个假定蛋白参与细胞脂肪酸代谢途径，研究表明在细胞应对溶剂压力时，这两个蛋白的上调可影响细胞膜脂肪酸的组成，导致细胞膜疏水性降低从而增强其对溶剂的排斥。本研究利用基因芯片技术对溶剂耐受菌株的基因转录水平进行了系统的分析，对微生物溶剂耐受性机制的阐明和相关菌株的构建提供了理论依据。

参考文献

[1] Alper H et al., Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Science, 314, 1565-8, 2006.

[2] Ni Y, Song L, Qian X, Sun Z. 2013. Proteomic analysis of Pseudomonas putida reveals an organic solvent tolerance-related gene mmsB. PLoS One 8(2):e55858.

[3] Qian X, Song L, Ni Y. 2014. Enhanced organic solvent tolerance of Escherichia coli by 3-hydroxyacid dehydrogenase family genes. Appl Biochem Biotechnol 172(6):3106-15.

通过代谢工程改造芽胞杆菌实现发酵过程及产品脱臭

魏雪团 陈杨阳 黄花花 陈守文

华中农业大学食品科学与技术学院，武汉430070

摘要：常用的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等，可分泌多种生物制品，具有重要的应用价值，广泛应用于农业、食品、医药、化妆品等领域。芽胞杆菌发酵过程产生的臭味物质会造成严重的负面效应，一方面，臭味废水、废气、废渣造成环境污染和人体不适，影响发酵产业的发展；另一方面，臭味物质影响食品、保健品、医药产品以及饲料产品的口感和气味，影响消费对象对其接受程度。因此，发酵过程及产品脱臭具有重要的意义。芽胞杆菌所产生的支链短链脂肪酸和生物胺等物质是其主要异味物质，由芽胞杆菌特定代谢途径产生。因此，通过代谢工程手段阻断臭味物质产生基因，同时不影响关键代谢物的产量，具有重要的意义。本课题组通过基因敲除阻断了地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌的支链锻炼脂肪酸形成的系列基因，显著降低了臭味物质含量，基本消除了所发酵产品的臭味，并评价关键基因缺失对目标代谢物的影响，获得了既可消除发酵产品臭味又可维持原代谢物产量的工程菌株，具有重要的工业化应用价值。

RAISE技术改组转录调控因子RpoD调控大肠杆菌低pH耐受性

高茜 朱丽英 江凌* 黄和

南京工业大学生物与制药工程学院，南京210009

摘要：发酵产业是我国生物产业的重要组成部分，其中，以有机酸、氨基酸为代表的传统发酵工业是我国发酵产业一个成熟的分支。但是，在有机酸或原材料酸解的生物转化过程中，微生物由于自身对酸性代谢产物或低pH环境的抗逆性差，其代谢活性受到严重影响。为解决该问题，本实验采用RAISE（Random Insertional-deletional Strand Exchange Mutagenesis）重组技术，将各种长度的随机插入、缺失和替代引入全局调控因子RpoD目的基因,构建大量区域交换随机突变文库，通过对突变文库的多轮迭代筛选，获得大肠杆菌的耐酸性能显著提高的突变菌株Mutant VII。实验表明，在pH 3.17时，相比原始菌株0.15 h 1的生长速率，该突变菌株展现出明显的生长优势，生长速率为0.22 h 1。结合转录组分析和表型组学分析进一步解析全局转录调控因子RpoD对大肠杆菌工程菌株的调控网络的影响。分析表明，菌株中共有95 (2.1%)个基因上调，178 (4.0%)个基因下调，所调控基因除与耐酸能力相关之外，主要涉及海藻糖合成，核酸利用，碳代谢，氨基酸利用等方面。此外，主要调控蛋白(ArcA, EvgA, H-NS，RpoS)和基因/启动子转录调控因子(GadX, GadW, AppY, YdeO, KdgR)都受到RpoD的影响。实验结果证明了RpoD在大肠杆菌生长阶段所起到的全局转录调控作用，不仅为后期改善不同大肠杆菌工业生产菌株的耐酸性能提供有力的理论依据，还为有机酸、氨基酸发酵行业的节能减排奠定了坚实的理论基础和技术源头。

参考文献

[1] Mazumdar S., Blankschien M. D., Clomburg J. M., et al, Microb. Cell Fact., 2013, 12 (7), 10-1186.

[2] Abdel-Rahman M. A., Tashiro Y., Sonomoto K., Biotechnol. Adv., 2013, 31 (6), 877-902.

[3] Dragosits M., Mattanovich D., Microb. Cell Fact., 2013, 12, 64.

[4] Alper H., Moxley J., Nevoigt E., et al, Science, 2006, 314 (5805), 1565–1568.

[5] Jiang L., Lin M., Zhang Y., et al, PloS One, 2013, 8 (10), e77437.

基于mariner转座子的产溶剂梭菌随机突变方法及其在优势表型

筛选中的应用

张慧1 徐舒1 张颖2 杨晟1 姜卫红1 Nigel P. Minton2 顾阳*1

1中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海200032；2 School of Life Sciences,

University of Nottingham, Nottingham NG7 2RD, UK

摘要：产溶剂梭菌（solventogenic clostridia）是一类重要的工业微生物。其底物谱广泛，可利用粮食淀粉、木质纤维素（秸秆、麦秆等）乃至含碳气体（如CO，CO2）等多种原料；且在发酵过程中可产生一系列有机酸和醇类化学品及生物燃料，如乙酸、丁酸、乙醇、丁醇、2，3-丁二醇等。因此，近年来产溶剂梭菌的基础应用研究受到广泛关注[1]。

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