响应面法优化疏螺旋体素发酵培养基(4)

/10.1016/j.ymben.2015.09.011.

酒石酸高效生物合成关键技术及其应用

李永泉* 张建国 谢志鹏 潘海峰

浙江大学生物化学研究所；杭州宝晶生物股份有限公司，杭州310058

摘要：酒石酸是重要的食品添加剂，主要用作葡萄酒与饮料的酸味剂、食品乳化剂合成原料等。浙江大学和宝晶生物股份历时10年产学研合作，建立了L-酒石酸高效生物合成技术，实现了连续化生产（连续运行90天），原料成本仅9000多元/吨，完全颠覆了欧洲人从葡糖酒酿造过程产生的酒石提取L-酒石酸的传统工艺(原料成本约2.5万元/吨)和现行批式生物合成工艺(原料成本约1.5万元/吨)，节能减排，消除了高氯废水的污染。

L-酒石酸高效生物合成技术已于06年在宝晶生物股份投产，2014年销售额逾4亿，80%出口，近三年销售总收入逾10亿、利税近3亿、出口创汇逾1.5亿美元；每年并产生间接经济效益60多亿。当我国有机酸产业普遍遭遇国际反倾销诉讼时，公司依托发明的创新技术于06年和2012年两次赢得欧盟对华酒石酸的反倾销诉讼，成为获“零反倾销税率”待遇的国内唯一企业，是国际最大的酒石酸生产商，全球市场占有率为30%以上。

项目组历时10余年，产学研合作联合攻关，建立了创新技术体系。（1）建立了酒石酸合成酶的高效可溶表达技术。从自然界筛选到产酶菌株，破译表达量极低的天然酶编码基因，通过JCat优化密码子、筛选温敏启动子PLPR、构建含融合标签的表达载体，实现高效可溶表达，成功制备了L-酒石酸合成酶、D-酒石酸合成酶。（2）构建了酒石酸合成酶重构技术，利用基因突变技术理性重构合成酶，大幅提高酶活力和热稳定性。重构的L-酒石酸合成酶工程菌酶活力达20万U/g，是野生型的20倍，最适稳定温度从35℃提高到40℃。（3）构建了高催化性能含酶细胞载体，解决了固定化细胞通透性、表面结垢等关键问题，提高了固定化催化剂催化效率。使用含酶细胞载体，L-酒石酸合成酶酶促效率由0.5kg/kg提高到0.7kg产物/kg细胞/小时。（4）采用生物合成与分离耦合技术，降低了产物抑制效应，提高了合成速率。通过反应与分离耦合，实现了L-酒石酸连续化生产（连续运行90天），相比批式技术底物摩尔转化率从80%提高到95%、原料成本降低38.8%，减排32.2%，基本消除了高氯废水的污染问题。

项目授权国家发明专利13项，受理欧洲专利1项，发表论文25篇（19篇SCI），获浙江省科学技术奖一等奖和教育部科技进步奖一等奖，生产的L-酒石酸被评为国家重点新产品，08年教育部组织项目鉴定，结论为“国际先进水平”。本发明技术已推广到D-酒石酸、酮基葡萄糖酸、苹果酸、没食子酸丙酯等有机酸及衍生物的开发，为有机酸产业转型升级、提高国际竞争力提供了技术支撑。

厌氧高效利用低劣生物质合成琥珀酸细胞工厂构建

姜岷 吴明科 马江锋

南京工业大学生命与制药工程学院，南京211816

摘要：琥珀酸是重要的碳四平台化合物，利用生物法替代石化法合成琥珀酸是大势所趋，其中开发实现利用低劣生物质原料合成琥珀酸是研究热点之一。然而，与淀粉基葡萄糖不同，以木质纤维素水解液为代表的低劣生物质中含有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等糖组分及预处理过程中生成的水解抑制因子，这些复杂成分构成的生物转化体系对生产菌株的底物利用范围、物质代谢能力及抗逆性能提出了新的要求。1) 为实现五碳糖的高效利用，分析比较产琥珀酸放线杆菌和大肠杆菌代谢途径的差异，发现ATP 供给不足是导致重组大肠杆菌丧失木糖代谢能力的关键因素。通过引入外源ATP合成途径，强化胞内能量的供给使大肠杆菌代谢木糖合成琥珀酸的效率提高12.4倍。[1] 进一步地，敲除糖转运调控基因（ptsG）解除了葡萄糖效应，实现了葡萄糖与木糖的同步利用，大大缩短了发酵周期。[2] 2)针对重组菌株厌氧条件下生长及代谢停滞，通过改造NAD(H)合成途径，调节了NAD(H)的总量以及NADH/NAD+的比例，增强了厌氧菌株代谢的速率，产物琥珀酸的合成速率提高了30.7倍。[3] 在此基础上，进一步改造胞内ATP代谢途径，获得了驱动力代谢调节能力优异的重组大肠杆菌BA209，菌株生长及产物琥珀酸合成速率明显提高。[4] 3)驱动力不仅参与菌体胞内物质的代谢，众多研究表明NADH和ATP（尤其是ATP）参与到菌株对于极端环境的耐受保护机制中。考察重组菌BA209对于低pH、高盐和高糖浓度的耐受性能发现其在相应的环境胁迫下菌株生长和代谢性能都得到了提高。[5] 本研究从驱动力的角度改造提高厌氧条件下菌株琥珀酸的合成性能，实现了利用低劣生物质高效合成琥珀酸，为利用低劣生物质炼制其它大宗化学品的提供了借鉴。

参考文献

[1] Liu RM, Liang LY, Jiang M et al. Fermentation of xylose to succinate by enhancement of ATP supply in metabolically engineered Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology, 2012, 94: 959-968.

[2] Liu RM, Liang LY, Jiang M et al. Efficient succinic acid production from lignocellulosic biomass by simultaneous utilization of glucose and xylose in engineered Escherichia coli. Bioresource technology, 2013, 149: 84-91.

[3] Liang LY, Liu RM, Jiang M et al. Effects of overexpression of NAPRTase, NAMNAT, and NAD synthetase in the NAD(H) biosynthetic pathways on the NAD(H) pool, NADH/NAD+ ratio, and succinic acid production with different carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Biochemical engineering journal. 2013, 81: 90-96.

[4] Jiang M, Chen X, Liang LY et al. Co-expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase and nicotinic acid

phosphoribosyltransferase for succinate production in engineered Escherichia coli. Enzyme and microbial technology, 2014, 56: 8-14.

[5] Wu MK, Guan Z, Jiang M et al. Efficient succinic acid production by engineered Escherichia coli using ammonia as neutralizer. Journal of chemical technology and biotechnology, doi: 10.1002/jctb.4828.

第二篇 分会报告

基于转录组学的大肠杆菌丁醇耐受性机制研究

司海明 张法 韩瑞枝 许国超 倪晔*

江南大学生物工程学院，无锡214122

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