? 菌落培养特征观察：用接种环沾取少量菌苔在牛肉膏蛋白胨平板上划线，37℃培养3-7d，从以下几个方面观察单菌落的形态特征：大小，颜色，形态，边缘，高度，透明度。
? 细菌个体形态的观察：革兰氏染色，油镜下观察菌株个体形状、排列、大小、芽孢有无及其形状、大小和着生位置。
? 细菌运动性的检查（半固体穿刺法）：用接种针沾取少量试验菌穿刺营养琼脂，适温培养2-3d，观察试验菌是否沿穿刺线向外扩散。（穿刺法：是由斜面菌种接种到固体深层培养基的方法。即用接种针取出少许菌台，自固体深层培养基中心垂直刺入直到试管底，然后轻轻退出。）
? 细菌的生理生化反应：
①氧化酶试验：取滤纸一张置于培养皿内，滴上二甲基对苯撑二胺，滴入量以滤纸湿润为度。如果加得过湿有碍菌苔与空气接触，延长显色时间，造成假阴性。用白金耳接种环挑18-24h的菌苔，涂抹在滤纸上，如呈玫瑰红色为阳性，在1min以后显示者仍按阴性处理。
②接触酶试验：接种试验菌，适温培养18-24h，将3%的过氧化氢滴于菌苔上，静置1-3分钟后，观察有无气泡产生，如有则为阳性。
③葡萄糖氧化发酵试验：将培养18-24h的菌株穿刺接种于葡萄糖氧化发酵培养基，每株接四支（培养基在使用前用沸水融化后迅速用冷水冷却，凝固后立即使用）。其中的两支用液体石蜡封管，隔绝空气为闭管，另外两只不封为开管。同时还要有不接种的开闭管为对照。30℃培养，在第1，2，4，7d个观察一次。氧化产酸：仅开管产酸变黄，而且培养基上层产酸变色部分不超过1cm。发酵产酸：开管闭管均产酸，沿穿刺线产酸变色。如产气，则在琼脂柱内产生气泡。
④V·P实验与M·R试验：两个试验的培养液相同，接种培养也相同，将试验菌接种于培养液中，适温培养2、4、6d。试验时取培养液1毫升加等量40%NaOH和0.5ml а-萘酚，用力振荡，15-30min后观察其颜色变化。红色则为阳性，黄色则为阴性。M·R试验，在培养液中加1-2滴甲基红试剂，如呈红色则为阳性，黄色则为阴性。
⑤淀粉水解试验：将试验菌在平板上点种，适温培养2-7d，滴加碘液于菌落上，如菌落周围为蓝色，表示未水解，观察菌落周围或菌落下有无无色透明圈，如有或呈红紫色则为阳性。
⑥明胶液化试验：将试验菌的幼龄菌体穿刺接种在明胶培养基中，以不接种的为对照，置20℃培养。在第4d取出于20℃以下的环境中观察菌的生长情况及液化形状。若
- 8 -
明胶表面无凹陷，凝块稳定则为明胶液化阴性，如明胶凝块部分或全部在20℃以下变为可流动的液体，则为明胶液化阳性。
⑦吲哚产生试验：培养液接种试验菌后适温培养，取培养2-7d的培养液，沿管壁缓缓加入3-5ml的吲哚试剂，液层界面出现红色表示产生吲哚，即为阳性。
⑧柠檬酸盐生长试验：将试验菌在平板上点种，适温培养3-5d，如该菌可在平板上生长并将培养基由原来的淡黄色变为玫瑰红色，则为阳性，颜色不变者为阴性。
⑨碳源的利用：将菌株在平板上点种，适温培养3-5d，同时每个试验菌都做一个未加含碳化合物的基础培养基作为对照。试验菌在含碳化合物培养基的生长明显超过基础培养基者为阳性，否则为阴性。
⑩耐盐性试验：将牛肉膏蛋白胨培养液中加入不同量的NaCl，如2％，5％，7％，10％等制成渗透压不同的培养液，接种，室温培养3-7d与对照管比较目测其生长状况，判断其对不同渗透压得耐受性。
3.4.4 酶活测定以及酶活定义[6]
采用 Yoo改良法，取 5mL质量分数0.5％ 可溶性淀粉溶液，在37℃ 水浴中预热 10 min，加入适度稀释的粗酶液0.5 mL，37℃ 水浴震荡，准确反应 5 min后 ，用5 mL 0.1 mol／L H2SO4终止反应。取 0.5 mL反应液与 5 mL稀碘液显色，在620 nm处测光密度。以0.5 mL水代替 0.5 mL反应液为空白，以不加酶液(加同体积的缓冲液)的管为对照。酶活力根据以下公式计算：
酶活力(U)= (R0一R)×50×D／R。
式中：R0，R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。
酶活定义为在 37 ℃ ，pH 6.0条件下，5 min内水解 1 mg淀粉的酶量为1个活力单位。
3.4.5 不同培养条件对产酶的影响 ? 起始PH对产酶的影响
在250 mL三角瓶中装入不同起始pH值的培养基50mL，起始PH分别是5、6、7、8和9，每个三角瓶接入种子培养基1ml后培养24h。
? 温度对产酶的影响
选取25、30、35、40、45℃作为培养温度，在摇瓶发酵培养条件下培养24h，分别测定不同温度对酶活的影响。
? 培养时间对产酶的影响
- 9 -
在250 mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，每个三角瓶接入种子培养基1ml后分别培养6h、12h、24h、36h、48h、96h分别测不同培养时间下的酶活 [7] 。
- 10 -
4 实验结果
4.1 初筛结果
表4-1 水解圈直径比
菌株 B1 B2 B3 B4 B5
菌体（D,mm）
2.5 2.8 2.0 2.1 1.7
水解圈(d,mm)
7.8 6.9 7.1 6.9 4.5
d/D 3.12 2.46 3.55 3.29 2.65
利用淀粉固体培养基进行初步分离，能够在其上生长，并且有淀粉水解圈产生的菌株即为要筛选的目的菌株。通过大量筛选，我们得到五株d/D较大的菌株，并斜面保存，以供后期复筛所用。
4.2 复筛结果
表4-2 水解圈测量
菌株 B1 B3 B4
滤纸片（D,mm）
5.0 5.0 5.0
水解圈(d,mm)
16.0 14.5 15.3
d/D 3.20 2.90 3.06
王丽丽等在进行产酶菌株的筛选时发现，平板菌落水解圈直径与其摇瓶酶活不相关，为此，本实验采用王丽丽等的筛选方法进行复筛，得出三个菌株的水解圈较大，斜面保存。
4.3 鉴定
对复筛出的三个菌株进行菌种鉴定，根据《伯杰式细菌鉴定手册》[8]，《常见细菌
- 11 -
鉴定手册》[9]，对照查找鉴定结果。
表4-3 细菌鉴定结果
性状 G染色 芽孢 细胞形状 接触酶 氧化酶 运动性 淀粉水解 M.R V.P 柠檬酸盐 吲哚 明胶液化 葡萄糖氧 化发酵产酸
表4-4 细菌耐盐性实验
盐浓度 2% 5% 7% 10%
B1 + + + +
B3 + + + +
B4 + + + -
B1 + 有 长杆状 - + + + + + + + + +
B3 + 有 长杆状 - + + + + + + - + +
B4 + 有 杆状 + - + + + - + - + -
表4-5 碳源利用实验
碳源 葡萄糖 乳糖 蔗糖 甘露醇
B1 + + + +
B3 + + + +
B4 + + + +
B1和B3菌落呈不规则状，不透明，干燥，色暗，革兰氏反应为阳性，芽孢椭圆状，中生，B4菌落边缘为毛发状，不透明，干燥，不宜挑起，革兰氏反应为阳性，杆状，芽
- 12 -
百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说教育文库产a-淀粉酶的枯草杆菌的筛选与产酶条件的研究(2)在线全文阅读。
相关推荐：