产a-淀粉酶的枯草杆菌的筛选与产酶条件的研究

产а-淀粉酶的枯草杆菌的筛选

与产酶条件的研究

1 引 言

枯草芽孢杆菌（B.S）属于芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，无荚膜，需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，是a-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。

淀粉酶属于水解酶的一种，是淀粉水解的生物催化剂。按降解方式分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和环糊精生成酶。α-淀粉酶以无规则的方式切断淀粉大分子内部的α-1，4糖甙键而使淀粉生成糊精、低聚糖等，因产物的末端葡萄糖残基中碳原子为α-构形，故称为α-淀粉酶。大多α-淀粉酶(个别品种除外)不能切断α-1，6糖甙键，也不能切断分支点附近的α-1，4糖甙键。目前，α-淀粉酶在我国产量较大，广泛应用于食品、酿造、制药和纺织等领域。用α-淀粉酶水解淀粉时，要注意水解条件。影响α-淀粉酶活性的主要因素有pH值、温度和金属离子[1]。

α-淀粉酶具有反应速度快、效率高、成本低等优势。对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真菌α-淀粉酶的需求量不断增加；另一方面，由于我国目前不能自主生产真菌α-淀粉酶，每年都要大量进口，且价格昂贵。因此尽快实现国产化生产，对于满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等都具有十分重要的意义[2]。

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2 文献综述

2.1 α-淀粉酶及其性质

2.1.1 α-淀粉酶

α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物，其国际酶学分类编号是EC．3.2.1.1，它作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖，由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶 [1] 。

2.1.2 α-淀粉酶的性质

一般α-淀粉酶在pH值为5.5-8.0时活性较稳定，pH小于4时，酶易失去活性。但有些α-淀粉酶是偏酸性或偏碱性的，如黑曲酶生产的α-淀粉酶最适合的pH为4，在pH为2.5、温度为40℃处理30min后仍有一定的活性，但在pH为7、温度为55℃处理15min，α-淀粉酶几乎失活。而用米曲酶生产的α-淀粉酶则相反，在pH为7、温度为55℃时处理15min，酶活性无损失，但在pH为2.5时，酶的活性完全消失。

α-淀粉酶具有反应速度快、效率高、成本低等优势。α-淀粉酶是一种金属酶，Ca2+使α-淀粉酶保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。除Ca2+外，其它二价碱金属离子Ba2+、Mg2+等也有维持α-淀粉酶活性的作用。耐中温α-淀粉酶为适应生产工艺的高温条件，有时需添加Ca2+等稳定剂，但耐高温α-淀粉酶在Ca2+浓度很低时，稳定性就很好。在实际使用时，不需添加Ca2+等稳定剂。

2.2 α-淀粉酶的应用

α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，它占了整个酶制剂市场份额的25％左右。目前工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶。

α-淀粉酶作为保鲜剂应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史。最近几十年，麦芽α-淀粉酶和微生物α-淀粉酶被广泛用于焙烤工业。这些酶用于面包工业，使这些产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软。直到今天，焙烤工业中的α-淀粉酶一直是从大麦麦芽和细菌、真菌叶提取的。自从1955年以及1963年在英国经过GRAS级验证后，真菌淀粉酶一直作为面包的添加剂。现在，它们应用于不同领域。现代化连续焙烤过程中，在面粉中添加α-淀粉酶不仅可以增加发酵率，降低生面团粘度(改

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进产品的体积和质地)，增加生面团中糖的含量，改良面包的口感、外皮颜色和焙烤质量，还可以延长焙烤食品的保鲜时间。在储存过程中，面包颗粒变得干燥，坚硬，表皮不再清脆，导致面包的口感变差。这些变化统称为变质。每年仅仅由于面包变质而造成的损失超过一亿美元。各种传统的添加剂被用于防止食品变质，改善焙烤食品的质地和口味。最近，人们开始关注酶作为防腐剂、保鲜剂在生面团改良方面的作用，如支链淀粉酶和一淀粉酶配合可以有效的用于防腐。然而过量的α-淀粉酶会导致面包过粘。因此，最近的趋势是使用中温稳定(ITS)α-淀粉酶，它们在淀粉液化后活性很高，但在焙烤过程完成前就失活。尽管已发现大量的微生物可以生产α-淀粉酶，但是具有中温稳定性质的α-淀粉酶仅仅在几种微生物中被发现。世界上仅有诺维信、丹尼斯克等少数几家大型酶制剂公司拥有真菌α-淀粉酶生产技术与产品，而国内真菌α-淀粉酶的生产还是空白。近年来，浙江、江苏等地的几家高校相继开展了真菌α-淀粉酶的研究工作，但仍处于实验室阶段。 对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真菌α-淀粉酶的需求量不断增加；另一方面，由于我国目前不能自主生产真菌α-淀粉酶，每年都要大量进口，且价格昂贵，其市场售价一般在350～400元／Kg（9000u／g）。因此尽快实现国产化生产，对于满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等都具有十分重要的意义[1]。

本实验主要是从土壤中分离得到产酶量相对较高的枯草芽孢杆菌，并从pH和培养温度等方面对产酶条件进行优化，最终的出最适宜的产酶条件。

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3 实验材料和方法

3.1 实验材料

3.1.1 土壤：取自蚌埠市李楼面粉厂周围的土壤。 3.1.2 所用的药品

蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙等。

3.1.3 所用的仪器

高压蒸气灭菌锅；pH测定仪；无菌操作台和JH752紫外可见分光广度计（上海箐华科技仪器有限公司）；KDC-160HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司）；AR-1140电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；HH-1数量恒温水浴锅（江苏省金荣华仪器制造有限公司）；DHZ-D冷冻恒温振荡器（江苏省太苍市实验设备厂）；电炉；烧杯；移液管； 三角瓶等。

3.2 培养基的制备

3.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基：

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，CaC12 5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

3.2.2 淀粉初筛培养基：

可溶性淀粉20g，KNO32g，MgSO41.2g，KH2PO42.7g，琼脂1.5-2%，PH值为7.0。 3.2.3 复筛液体培养基：

淀粉60g，蛋白胨30.0g，Na2HPO40.05g．MgSO4·7H2O 0.1g，NaC1 0.1g，pH 7.0，0.1MPa灭菌20min。

3.2.4 复筛平板培养基：

淀粉20g，琼脂15g，pH值为7.0，加热溶化后倒平板，每皿20mL，厚3mm；

小圆滤纸片：直径5mm。 3.2.5 种子培养基：

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蛋白胨10 g/ L，酵母膏5 g/ L，葡萄糖1 g／L，NaH2PO43 g/ L，pH 7.0。 3.2.6 产酶培养基：

蛋白胨10 g/ L，酵母膏5g /L，葡萄糖1g／L，可溶性淀粉5 g/L，KI-I2PO42 g/L，MgSO4 ·7H2O 0.5 g /L，CaC12·2H2O 0.2g／L，pH 7.0。

3.3 试剂的制备

3.3.1 5 mmol／L碘液

取碘酸钾(KIO3)0.356 7 g，碘化钾(KI)4.5 g，蒸馏水800 mL搅拌混匀后，缓缓滴加，边搅边加入l2 mol／L浓盐酸0.9 mL。混匀后加蒸馏水至1000 mL。此液置琥珀色瓶中。

3.3.2 1mol／L NaOH

取4g固体NaOH放入100mL蒸馏水，混匀。 3.3.3 1mol／L 硫酸

取10mL浓硫酸倒入100mL蒸馏水中，搅拌混匀。

3.4 实验方法

3.4.1 初筛[3]

称取土样 5g，倒入盛有95mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡 30 min制成土壤悬液记为 l0-1土壤稀释液。用无菌移液管吸取 10-1的土壤悬液 0.5 mL，放入 4.5mL无菌水中，混匀即为 l0-2稀释液，照此分别制成 l0-3～ l0-6 的稀释液，分别取 10-4、l0-5、l0-6土壤稀释液各0.5 mL，涂布于淀粉初筛平板培养基表面，每个稀释度涂布3块平板，37℃下恒温培养 18h，待长出菌落后，滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，反复划线分离纯化，斜面保存，作为初筛菌株编号保藏。

3.4.2 复筛[4]

将初筛菌株接种到复筛液体培养基中进行液态培养，发酵48h后，取直径 5 mm的小圆滤纸片，放于 3 mm厚的复筛固体培养基上，用毛细管吸取等量发酵液，分别滴到小圆滤纸片上，65℃培养2h后，滴加稀碘液，测水解圈直径 。

3.4.3 鉴定[5]

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