1. 拆下电泳装置，剥下聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用双蒸水
冲漂洗2次；
2. 加入500ml 10％乙醇固定液，在摇床上固定8～10 min，弃去反应液； 3. 加入500ml 1％HNO3氧化，在摇床上轻摇8～10 min，弃去反应液，
用双蒸水漂洗2次；
4. 倒入500ml 0.2％AgNO3银染液，染色15～30 min，弃去反应液，用双
蒸水漂洗2次；
5. 加入500ml 3％Na2CO3显色液，手摇显色至出现清晰的银染带，迅速
弃去反应液；
6. 用500ml 3％HAC停止显色；
7. 将已经染好的聚丙烯酰胺凝胶置于透射白光板上，观察酶切反应结果、
记录并拍照。
1.2.5.统计分析
基因频率与基因型频率使用软件SPSS10.0进行统计分析，不同基因型对产羔数的最小二乘均值分析使用SAS（8.0版）GLM（General Linear Model）软件包进行，模型如下：
Yijkl=μ+Gi+Pi+eijk
Yijkl为产羔数，μ为群体均值，Gi为基因型效应，Pi为胎次效应，eijk
为随机效应。 基因效应分析： 加性效应=（GG-AA）2 显性效应=AG-（AA+GG）2
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
16 扩增波尔山羊和马头山羊基因组，产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的片段与预期片断大小一致（197bp），条带清晰（图1），特异性高，满足后续分析要求。
图1 PCR扩增结果
注：M， MarherⅠ 100bp DNA Ladder；1、2、3为波尔山羊DNA扩增产物；4、5、6为马头山羊DNA扩增产物
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR product.
M，1-3，4-6: 100bp DNA Ladder， PCR product of ?goat， PCR product of ?goat
2.2酶切结果
利用限制性内切酶HinfⅠ对PCR扩增产物进行酶切，使用8%的聚丙烯酰胺凝胶（29：1）电泳检测酶切产物。
在197 bp的扩增片段在118bp处存在另一HinfⅠ酶切位点，酶切后产生118 bp和79bp片段，其中波尔山羊在118处的酶切位点存在多态性，酶切位点的存在与缺失产生2 种基因型，分别命名为AA和GG:AA （ 118bp 118 bp ） 、GG（118bp 79bp ） ，酶切图谱见图2 ；而马头山羊在118处的酶切位点则无多态性，基因型均为AA型。酶切图谱见图3 。
17
图2 波尔山羊酶切图谱
注：M， pBR322Msp 1 Marher；1～13为酶切产物条带 Fig.2 genotypes of the M TNR1A fragment defined by PCR-RFLP
图3 马头山羊酶切图谱
注：M， pBR322Msp 1 Marher1～8为酶切产物条带 Fig.3 genotypes of the M TNR1A fragment defined by PCR-RFLP
2.3 褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果
18 分析两种山羊品种的褪黑激素基因型频率发现，在该酶切位点，马头山羊只出现AA基因型，波尔山羊虽然出现两种基因型，但AA型频率高于GG型。在所检测的两个群体中，A等位基因是优势等位基因。 表6 山羊MTNR1A基因HinfⅠ酶切基因型和基因频率分布表
Table 6 Genotype and allele frequencies of HinfⅠ-RFLP for the Goat M TNR1A gene 基因型频率
品种 Breed
数量
N
基因型
Genetype
Genetype
frequency
AA
波尔山羊
65
GG
马头山羊
51
AA
0.446 1
G 0.446 A 1
0.554
A 0.554
Allele frequency 等位基因频率
2.4 MTNR1A基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析
由表7可知，波尔山羊的AA基因纯合型头胎平均产羔数比GG基因杂合型多0.07只，加性效应值为0.035，显性效应值为-1.42。研究表明：波尔山羊的A等位基因可能与山羊头胎产羔数呈正相关，该位点主要以加性方式起作用。 表7 波尔山羊析
Table 7 Least squares means and allele substitution effects for litter size at first kidding in boar goat
19 MTNR1A基因型对头胎产羔数性状的最小二乘均值及基因效应分基因型
品种 Breed
数量
Genetyp
N
e AA
波尔山羊
65
GG
最小二乘均值±标准误 Least
加性效应 显性效应
squares additive dominant
effects
means±standard error effec 1.4545±0.5222
0.035
1.3846±0.5064
-1.42
2.5 MTNR1A基因型与经产产羔数性状的关联分析
由表8可知，波尔山羊的AA型经产羔数比GG型多0.09只；加性效应值为0.046，显性效应值为-1.84。结果表明：A等位基因可能与波尔山羊产羔数呈正相关，该位点主要以加性方式起作用。
表8 波尔山羊MTNR1A基因型对经产产羔数性状的最小二乘均值及基因效应分析
Table 8 Least squares means and allele substitution effects for litter size in multiparous boar goat
最小二乘均值±标准误
基因型
Least squares means±standard additive
Genetype
error
AA GG
1.8827±0.5871
0.046
1.7905±0.5988
-1.84
effects
effects dominant
加性效应
显性效应
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