（强烈推荐）山羊褪黑激素受体1A基因Hinf酶切多态性及其与产羔数(2)

用。

关键词：山羊；繁殖性状；褪黑激素受体；PCR—RFLP

HinfⅠ-RFLP of Melatonin receptor 1 A（MTNR1A） gene and the association with the litter size traits in goat Abstract

In the present study， Melatonin receptor 1 A gene （MTNR1A） was analysed to find the assocation with litter size in goat as a candidate gene. HinfⅠ-RFLP （Restriction Fragment Length polymorphism， RFLP） of MTNR1A was found in 65 Boer goats and 51 goats Ma Tou. No polymorphism was detected in Ma Tau goats . Two genotypes AA， GG were found in Boer goats. The frequency of AA genotype was GG genotype， which were 0.554 and 0.446， respectively. The allele frequencies for A and G were 0.554 and 0.446. The results of traits association analysis showed that individuals with AA genotype Boer Goat. The additive effect value was 0.035， while the dominant effects value -1.42. Moreover， AA genotype Boer goats. The additive effect was dominant at the site.

Key words: Goat； Reproductive traits； MTNR1A； PCR-RFLP

前 言

褪黑激素主要是由松果体合成的，其它合成部位还有:视网膜、眼眶腔的副泪腺、唾液腺、肠的嗜铬细胞及红细胞，松果体把对外界光照形成的神经信息经下丘脑视交叉上核转变成体液信息—MEL。 1.褪黑激素生理功能、作用机制；

褪黑激素对生殖系统作用的机理主要是通过光作用于视网膜，然后通

6 过视网膜- 下视丘至视交叉上核，再经过一系列复杂的神经交换至颈上神经节，其节后交感神经作用于松果体。松果体分泌褪黑激素，通过下丘脑—垂体性腺轴影响生殖系统。褪黑激素对生殖系统的作用因动物种类、生理状态不同而表现出抑制、促进或无作用的多重性（焦传珍，2005）。多项研究结果表明，褪黑激素虽然对牛、鼠类、禽等动物和人的生殖系统的发育有抑制作用，但是对绵羊、山羊、鹿等动物则明显表现出促进作用。 2．褪黑激素受体类型、作用机制；

褪黑激素受体属于G蛋白耦联受体家族。根据其分子生物学方法又可分为MTNR1A、MTNR1B、MTNR1C三种亚型（张凯等，2006）。目前在哺乳动物中还没有发现MTNR1C受体，而具有明显季节性繁殖特征的动物仅在垂体结节部发现MTNR1A受体，提示垂体结节部可能是褪黑激素繁殖效应的作用位点。

3．褪黑激素受体分子标记在其它动物中的研究进展

目前国内外对绵羊M TNR1A 基因已经有所研究已经很多了。Messer等（1997）和Notter等（2003）用M n lⅠ和R saⅠ酶分别对白面杂种羊、萨福克羊、特克塞尔羊、柯泊华斯羊和合成系绵羊群体M TNR1A 基因外显子2 的824 bp扩增产物进行消化，发现M n lⅠ在5 个绵羊群体中都存在286 bp和236 bp多态片段， R saⅠ都存在295 bp 和290 bp 多态片段。Pelletier等（2000）用M n lⅠ限制性内切酶消化2组发情行为有明显差异（常年发情和季节性发情）的Merinos d′Arles母绵羊以及季节性发情明显的Ile2de2France 母绵羊M TNR1A基因外显子2的824 bp扩增产物，发现存在303 bp和236 bp 多态片段。季从亮等（2003）和Chu等（2003）用M n lⅠ和R saⅠ对常年发情的小尾寒羊和湖羊以及季节性发情的多赛特羊和萨福克羊共146只绵羊M TNR1A 基因外显子2的824 bp 扩增产物进行PCR-RFLP多态性分析，发现M n lⅠ在4个绵羊品种中都存在303 bp

7 和236 bp多态片段， R saⅠ都存在290 bp和267 bp 多态片段。在绵羊中的研究结果表明，该基因对绵羊繁殖性能存在影响。但是，对于山羊，只有对产绒或营养调控的研究，目前尚未发现有对山羊繁殖性能影响的相关报道。

4．本实验目的意义

本实验室滑国华等（2006）在山羊MTNR1A中共发现7个SNPs，对其中4个SNPs分析结果显示：MTNR1A不同基因型对山羊产羔数性状有一定的影响。为进一步研究该基因对山羊产羔数性状的影响，本试验选取G493A突变位点，采用引入酶切位点方法，即限制性片段长度多态性Forced PCR-RFLP（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphsim），分析该位点在马头山羊和波尔山羊中的分布情况，并分析该位点对波尔山羊产羔数影响，为山羊标记辅助选择提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

马头山羊51头，采自湖北省十堰市；波尔山羊65头，采自湖北省宜都市波尔山羊种羊场。颈静脉采血10ml只，EDTA抗凝，-20℃保存。

1.1.2 实验材料

1.5ml Eppendorf管、双面板、微量移液枪（1000μl、200μl、40μl、10μl、2.5μl）及枪头、 一次性PE塑料手套。

1.1.3主要试剂的来源

TagDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司； DNA限制性内切酶HinfⅠ购自晶美生物工程有限公司；

8 分子量标准100bp DNA Ladder和PBR322DNAMspI购自上海生工生物工程技术有限公司；

三羟甲基氨基甲烷（Tris）、苯酚、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、甲酰胺、丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）、N－N’－亚甲基丙烯酰胺（Bisacrylamide）、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、乙二胺乙二酸二钠盐（EDTANa2）等均购自武汉凌飞科技有限公司。

1.1.4主要仪器设备

表1 主要仪器设备

Table 1 Laboratory equipment and instruments

仪器设备名称 电热恒温水浴锅 台式离心机 梯度PCR仪 冷冻离心机 恒温摇床

自动双重纯水蒸馏器 紫外分析仪 电泳槽 稳压稳流电泳议 手提式高压灭菌锅 超纯水仪 移液器

10μl；2.5μl 型号 GD120 TGL-16G T1 Thermo cyler Centrfuge 5810 HS80 SZ-93 UV-IV DYY-III DYY-2

YXQ-SG46-280A

备厂

WaterPro

1ml；200μl；40μl；

芬兰Labsystems公司 美国LABCONCO公司 生产厂家 英国Grant公司 上海安亭科学仪器厂 德国Biometra公司 德国eppendorf公司 中国科学院武汉科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 北京市新科技应用研究所 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂

上海博讯实业有限公司医疗设

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1.1.5主要试剂的配置

1.1.5.1用于血液样品采集的溶液的配制

1) 1M Tris.cl储备液：称取121.4g Tris碱溶于800ml双蒸水中，加浓盐

酸调至pH=8.0，定容到1000ml。高压灭菌，室温保存；

2) 0.5M EDTA（pH=8.0）：称取186.1g Na2EDTA·2H2O溶于800ml双蒸水中，

加入NaOH（约20g）调至pH=8.0，定容到1000ml。高压灭菌，室温保存； 3) 10%SDS：称取50g SDS加热溶于400ml双蒸水中，定容至500ml。高压灭

菌，室温保存；

4) 抗凝剂（0.2MEDTA）：量取200ml 0.5M EDTA加入双蒸水定容至500ml。 1.1.5.2 用于基因组DNA提取的溶液的配制

1) 蛋白酶K：称取200mg蛋白酶K溶于10ml双蒸水，以1ml分装，-20℃冷冻

保存；

2) 氯仿异戊醇（24:1）：量取480ml氯仿，加入20ml异戊醇，混匀； 3) 3M NaAc：称取NaAc·3H2O溶于400ml双蒸水中，用HAc调至pH=5.2，加

水定容至500ml。高压灭菌，室温保存；

4) TE缓冲液：100mM Tris·cl（pH＝8.0），1mM EDTA（pH＝8.0）。 1.1.5.3 用于琼脂糖凝胶电泳及检测溶液的配制

1) 50×TAE储备液： 称取242g Tris碱溶于750ml双蒸水中，加入57.1ml

HAc、100ml 0.5M EDTA（pH＝8.0），加水定容至1000ml；

2) 5×TBE储备液：称取54g Tris碱和27.5g硼酸溶于750ml双蒸水中，加

入20ml 0.5M EDTA（pH＝8.0），加水定容至1000ml；

3) 6×上样缓冲液：0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青，15%Ficoll聚蔗糖； 4) 溴化乙锭（EB，10mgml）:100ml双蒸水中加入0.1g EB，搅拌使完全溶

解，转入棕色试剂瓶，锡箔包裹。

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