酸性微环境对单核巨噬细胞分泌血管内皮细胞(2)

酸性微环境对单核巨噬细胞分泌血管内皮细胞

华西口腔医学杂志第28卷第4期2010年8月

WestChinaJournalofStomatologyVol．28No.4Aug.2010http：//http://www.77cn.com.cn

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科技有限责任公司），抗CD68单克隆抗体、无钙镁PBS液（武汉博士德生物工程有限公司），RPMI-1640培养液（Gibco公司，美国），胎牛血清（杭州四

季青生物工程材料有限公司）。Tca8113人舌鳞癌细胞株购自上海中国科学院细胞库。

1.2方法

1.2.1单核/巨噬细胞的获取及鉴定取健康人新鲜外周抗凝血20mL，采用密度梯度离心法，分离单个核细胞，通过2次贴壁法，使单个核细胞贴壁，加入RPMI-1640（含10%胎牛血清、1%双抗）在37℃，5%CO2培养箱中继续培养，每隔3d换液，到第7天时采用机械法收获贴壁的单核/巨噬细胞。

单核/巨噬细胞的鉴定：采用流式细胞仪，用抗CD68单克隆抗体分析悬液中的细胞，单核/巨噬细胞定义为CD68阳性细胞，结果CD68阳性细胞占94.03%，满足实验需要。悬液涂片后，以瑞氏染色计数单核/巨噬细胞数目，胎盘蓝染色计数死细胞，中性红计数活细胞，结果细胞活性大于96%。1.2.2MTT法检测单核/巨噬细胞的体外杀瘤活性A组：用25%Hepes和7.5%NaHCO3调整RPMI-1640培养液pH值为7.2，按1∶5效靶比分别把效应细胞（单核/巨噬细胞，每毫升0.2×106个）和对数生长期靶细胞（Tca8113细胞，每毫升1×106个）加入96孔板，每孔各加入100μL。另设单独的效应细胞和靶细胞组，每组设5个平行孔。4h后，每孔滴加MTT（5mg·mL-1）10μL，继续培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜100μL，振荡溶解15min后，用酶标仪570nm测光密度值（A），按下面公式计算单核/巨噬细胞的杀瘤活性。杀伤活性（%）=[1-（实验组A值-单独效应细胞A值）÷单独靶细胞A值]×100%。B组：用pH值6.8的RPMI-1640培养液进行上述培养及检测。C组：用pH值6.6的RPMI-1640培养液进行上述培养及检测。

1.2.3ELISA法进行培养液中VEGF的测定pH7.2组：将Tca8113培养上清液（每孔0.3mL）、单核/巨噬细胞（每孔0.3mL，每毫升0.2×106个）加入12孔板中，调整RPMI-1640培养液pH值为7.2，分别在3、5、7h后收集培养上清液，采用人VEGFELISA试剂盒进行检测，操作步骤严格按照说明书进行，每组设5个复孔。

pH6.8组：调整RPMI-1640培养液pH值为6.8进行上述培养及检测。pH6.6组：调整RPMI-1640培养液pH值为6.6进行上述培养及检测。1.3统计学处理

应用SPSS10.0软件，采用配对t检验，P＜0.05具有统计学意义。

2结果

2.1

酸性微环境下单核/巨噬细胞对人舌癌细胞系Tca8113的杀伤活性的影响

倒置显微镜下观察，在混合培养中可见到单核/巨噬细胞围绕Tca8113细胞，并可见癌细胞被单核/巨噬细胞所吞噬及裂解（图1）。图2为不同pH值进行混合培养下的单核/巨噬细胞对Tca8113细胞4h的杀伤率，由图2可以看出，单核/巨噬细胞在pH值6.8和pH值6.6环境下的杀瘤活性均低于pH值7.2环境下（P<0.05）。

图1混合培养下的单核/巨噬细胞和Tca8113细胞倒置显微

镜

×400

Fig1

Monocytes/macrophagesandTca8113cellsinco-culturedinvertedmicroscope

×400

图2不同pH值单核/巨噬细胞对Tca8113舌鳞癌细胞系的杀伤活性

Fig2

Thekillingactivityofmonocytes/macrophagestoTca8113cellsindifferentpH

2.2酸性微环境对单核/巨噬细胞分泌VEGF的影响应用ELISA法，分别在3、5、7h3个不同的时

间点，检测不同微环境下单核/巨噬细胞分泌VEGF的情况，实验结果表明，在pH值6.6、6.8的环境下，VEGF的分泌在不同时间点之间无明显统计学差异P>0.05），但均高于在pH值7.2的环境下（P<0.05），且VEGF的分泌水平随着时间的推移而升高

（表1）。（

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