Cre_lox位点特异重组系统在植物基因工程中的应用(3)

年第期

陈广东等：Cre/lox位点特异重组系统在植物基因工程中的应用

方法对得到的单拷贝转基因植株进行了检测，发现有73%的单拷贝转基因植株中发生了DNA片段的倒转，于是De Paepe等对此方法进行了优化，构建了两个不同的T-DNA载体，这两个载体上都只含有一个lox位点，再将两个T-DNA载体转化进带有Cre表达载体的植株中，检测得到其中单拷贝转化体所占比率约为70%。

loxP位点间序列，35S启动子使GAL4-VP16表达，GAL4-VP16与UAS结合，进而激活UAS下游的目的基因GOI表达。由于GAL4-VP16/UAS作用体系使其下游靶基因与标记基因GFP具有相同时空表达模式，所以，检测到GFP信号就标志重组事件获得成功，通过GFP可直观分析目的基因表达与启动子的作用。

2.3 激活功能基因

将目的基因通过载体系统转入高等植物已经成

为植物转基因中的基础技术，它对研究目的基因转录、mRNA稳定性、翻译等具有重要作用。随着生物技术的发展，对目的基因表达的可控性要求越来越高。利用Cre/lox重组系统能激活基因表达，可使功能基因的表达具有时空控制性。Tungsuchat等［23］通过Cre/lox重组系统删除了阻断序列，创造了一个可翻译的读码框，从而使目的基因激活（图1）。在载体选择标记基因aadA的下游引入gfp，aadA是阻断序列，其位于两个方向相同的loxP位点之间。在非激活状态下gfp能够被aadA的启动子驱动转录，但由于缺少AUG翻译起始密码子，使其mRNA不能被翻译。当通过Cre重组酶删除阻断序列后，gfp编码区同翻译起始密码子连接起来，使gfp表达，通过是否能检测到gfp来验证该系统。

图2 Cre/loxP

载体激活系统模式

3 Cre/lox重组系统在基因定点整合上的应用

定点整合对于转基因植物来说较重要，它能确保外源基因整合到一个安全的基因组位点，防止内源基因的破坏，使植物的转基因表达都维持在一个相似的水平，保持转基因后代的稳定遗传。目前，能够达到这些目标的最可靠的方法是特异位点重组介导的定点整合，其中Cre/lox特异位点重组系统是应用比较广泛的方法［25］。利用Cre/lox特异位点重组系统实现转基因的定点整合需要破解的一个难题是：Cre/lox重组反应的双向性，由于Cre/lox的重组反应对单分子反应的偏好性大于双分子反应，导致插入的DNA片段经常被删除。因此，目前主要有3种策略来实现Cre/lox介导的定点整合，使整合进的DNA片段更加稳定。

3.1 共整合策略

图1 利用Cre/lox构建的载体激活系统

［23］

在植物基因组中，第一个被证明的定点整合策

略是共整合策略。有两种途径来提供Cre酶的活性：一是将Cre基因引入基因组中，使Cre基因稳定表达，这样在发生整合后，lox片段位于启动子和Cre基因之间，使随后Cre基因的表达被打断［26］（图3-a）。二是Cre基因载体的瞬时表达［27］。这个途径能使整合发生后Cre的表达最小化，从而阻止删除反应的发生，但此种方法的整合效率相对较低，并且可能发生Cre的随机插入（图3-b）。

为研究分析目的基因与启动子功能，本实验室成功构建了Cre/loxP重组激活系统［24］。该激活系统是建立在两个载体的基础上（图2），将pI-GFP和pGⅡ-GOI-HSCREN2 两载体共转入拟南芥中，筛选出共转化体。Hsp启动子经胁迫处理后激活Cre重组酶表达，Cre重组酶识别并删除同向重复的两个

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