第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体(7)

④可产生大片段外源单链DNA(可得到较长的外源DNA之单链序列)由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA的单链序列。

3．若干常用的噬菌粒载体

用来自不同丝状噬菌体的基因间隔区插入不同的质粒中，已获得一批噬菌粒。(目前还构建成了一批更加复杂的噬菌粒系统)。若干常用的噬菌粒的基本特征及其寄主菌株列于下表之中。

常用噬菌粒特征一览表

质 粒

pEMBL(From pUC8 pBR322

pRSA101(From?VX

基因间隔区

f1 M13 M13

辅助病毒

IR1, f1的一种抗干扰变异

株

野生型M13噬菌体 一种对于带M13基因间隔区的质粒所引起的干扰具有抗性的M13变异株 M13 K07，其基因II发生突变，相应产物对克隆于pUC119/pUC118的基因间隔区的作用优于对自身间隔区的作用。 M13K07

寄主菌株 71/18 KK2186 XS127 XS101 MV1184

pUC118/pUC119(From pUC18/pUC19

M13

pBluescript f1 XL1-Blue

* pBluescript是一种常用的噬菌粒，它的全名称应是pBluescript M13(+/-)，或者是分开写成pBluescript M13+、pBluescript M13-；它们是一对带有f1噬菌体DNA复制起点的载体。该起点以互为相反的方向插入到含有T3和T7噬菌体启动子的一个来自pUC19质粒的载体当中。

4．PBluescript噬菌粒载体 (1)体外转录载体：

定义：将T3、T7或SP60噬菌体的启动子，组入到噬菌粒载体

多克隆位点区(MCS)的两侧，便构成了一类新型的噬菌粒载体，叫体外转录载体。

a. 有一类噬菌体(如T3、T7及沙门氏菌的SP6等)

具有编码自身RNA聚合酶基因

此类phage RNA聚合酶基因的转录活性是由寄主RNA聚合酶控制的。

b. 但是，噬菌体晚期蛋白质“或是子代噬菌体的结

构组份，则是由噬菌体基因编码的。

此类噬菌体基因的转录活性是由噬菌体自身的RNA聚合酶控制的。

c. 噬菌体RNA聚合酶的活性效应具有高度的专一

性，只能转录具有噬菌体待定启动子的基因。而且每一种此类噬菌体的RNA聚合酶所识别的自身启动子也是高度特异的。

由于上述这三种原因，所以将T3、T7或SP6噬菌体的启动子

序列组入到噬菌体载体的多克隆位点区(MCS)的两侧，便构成了一类新型的噬菌粒载体，特称为体外转录载体(in vitro transcription vectors)。

在体外系统中，加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可使相应的噬菌体启动子发生功能作用，从而使插入在多克隆位点中的外源DNA发生转录作用。*

*即加T3 RNA聚合酶，就会启动T3启动子进行转录；加入T7 RNA聚合酶就会启动T7启动子进行转录。 (2)pBluescript噬菌粒载体的结构特征 名称的来源与沿革：

“pBluescript”是一专用商品名称，系指由Stratagene公

司发展的一类从pUC载体派生出来的噬菌粒载体。 此类载体正名为：pBluescript M13(+/-) 以后改名为：pBS(+/-)

现在叫做：pBluescript KS(+/-)或pBluescript SK(+/-) 符名注释：

*1.SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI方向转录的。

*2.KS表示多克隆位点区的另一种取向，即lacZ基因是按照KpnI→SacI方向转录的。

*3.(+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反取向。 pBluescript噬菌粒载体的结构特征：

pBluescript噬菌粒是从pUC19派生而来的分子量为3204bp的噬菌粒载体。它带有如下主要组成部分：

*1.1个ColE1质粒的复制起点——产生双链DNA *2.1个氨苄青霉素抗性基因——供作转化子克隆的选择记号

*3.1个来自pUC19的多克隆位点区——用以克隆外源基因

*4.围绕多克隆位点区(MCS)两侧的T3和T7启动子——指导外源基因的转录活性

*5.1个lacZ基因——供Xgal-IPTG显然反应，选择重组子

*6.1个M13复制起点——产生单链DNA

pBluescript噬菌粒结构特征：

图5-40 pBluescript SK(+/-)噬菌粒载体的分子结构图

它是从pUC19质粒载体派生而来的。SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SanI→KpnI的方向转录的；反之，KS则表示多克隆位点区的另一种取向，即lacZ基因是按照KpnI→SacI方向转录的。(+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。其中，f1(+)起点表示，当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA，即?-半乳糖苷酶基因的编码链DNA；而f1(-)起点则表示，当pBluescript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA，即?-半乳糖苷酶基因的非编码链DNA。

(3) pBluescript噬菌粒载体的体外转录

*1. pBluescript噬菌粒载体具有双向转录功能的原理。 在该噬菌粒载体的MCS序列区的两侧，分别存在着两个启动子，即T3和T7。因此当某一特定的外源DNA插入在MCS上的任何位点上，便有可能发生两种不同的体外转录反应：

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