糖化酶固定化实验报告

糖化酶固定化实验报告

学 号： 080500130 姓 名： 黄兆峰 专 业： 微生物工程 其他组员：黄志成、 李盟 、苏温培 指导老师： 朱秋享 实验时间： 2008.11.5—2008.11.7

一、目的要求

本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。 二、基本原理

游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。

酶活测定原理：糖化酶（即淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

本次固定化酶使用的方法是包埋法，将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法成为包埋法。包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法为凝胶包埋法。本次实验中具体使用的方法为海藻酸钙凝胶包埋法。

三、实验仪器及材料

1、实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL6号针头、冰箱、其他实验常用玻璃仪器

2、糖化酶、海藻酸钠、明胶 四、试剂配方 1、2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉碎2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml，此溶液需当天配制。 2、1mol/LpH4.5醋酸钠缓冲液

取无水醋酸钠8.024g，先在少量水中溶解，定容至1000ml。取分析纯冰醋酸5.78ml定容至1000ml。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求的缓冲液。 3、0.05 mol/L碘液：

称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中。

4、0.1 mol/L氢氧化钠溶液：

称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。 5、1 mol/L硫酸 ：

吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。

6、0.1 mol/L硫代硫酸钠：

称取26克硫代硫酸钠和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。 五、实验步骤 1、酶活测定 ⑴ 操作步骤

取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入待测酶液2毫升(空白以蒸馏水代替酶液)

准确计时1小时。取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入 2N硫酸 2毫升。用 0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。 ⑵ 计算

酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2/V3 *2 A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数； B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；

90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数； V1—反应液总体积(32.20毫升)； V2—吸取反应液样品体积(5毫升)； V3-吸取酶液毫升数(2毫升)；

2—反应30min,换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数； N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。 2、米氏常数的测定

取1ml游离酶，分别以0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，1.00%，2.00%浓度的可溶性溶液为底物，在40℃下反应10min，采用以上的方法测定游离酶活，做Line weaver-Burk双倒数曲线图，即以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标。其斜率即为米氏常数。 3、糖化酶的固定化

将酶液15ml游离酶与3%的海藻酸钠150ml混合，然后加入3%的明胶溶液150ml混合乳化约10min，调pH为4，慢速搅拌并降温至5～10℃，通过6号注射针头将上述冷却液以5cm的高度注进1%氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4℃，球在氯化钙溶液中被硬化30min，固定化酶被贮存在0～5℃冰箱。

4、固定化酶的酶活测定 ⑴ 操作步骤

取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入固定化酶5g(空白以蒸馏水代替固定化酶)准确计时1小时。取出过滤终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入 2N硫酸 2毫升。用 0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。 ⑵ 计算

酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2

A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数； B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；

90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数； V1—反应液总体积(32.20毫升)； V2—吸取反应液样品体积(5毫升)； N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。 5、固定化酶活力回收测定

固定化酶活力回收=固定化酶总活力/溶液酶总活力X100%

6、固定化酶半衰期测定

六、实验数据与数据处理 1、

表1 糖化酶酶活测定 空白硫代硫酸钠溶液消耗体积ml 9.4 样品硫代硫酸钠溶液消耗体积ml 4.5 酶的比活力 u/g 19312 2、 表2 糖化酶米氏常数测定 底物浓度 0.20% 0.30% 0.40% 0.50% 1.00% 2.00% 空白滴定8.9 9.0 9.0 8.95 9.05 8.9 体积ml 样品滴定8.3 7.9 7.8 7.5 6.4 5.45 体积ml [S]mg/ml 0.016 0.024 0.032 0.039 0.078 0.155 1/[S] 64.4 41.67 31.25 25.76 12.88 6.44 V 34.79532 63.79142 69.59064 84.08869 153.6793 200.0731 mg/min 1/v 0.0287 0.0157 0.0144 0.0119 0.0065 0.0050 以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标，做Line weaver-Burk双倒数曲线图，其斜率即为米氏常数。Km=0.0004/0.0015=0.267

游离酶Lineweaver - Burk图法求Km值0.0350.030.025y = 0.0004x + 0.0015R2 = 0.9741/v0.020.0150.010.005001020301/[S]40506070

图1 Line weaver-Burk双倒数曲线图

3、

表3 固定化酶酶活测定 编号 管1 管2 空白消耗体积 样品消耗体积 9.05 9.00 7.85 7.80 酶比活力u/g 平均比活力u/g 7.85 7.85 7.85 4、固定化酶回收率的计算：

100ml胶酶溶液相当的酶活力u＝总的固定化酶质量×固定化酶比活力 ＝45.6×7.85 =357.96(u)

315ml胶酶溶液相当于15ml酶溶液活力u＝

100ml胶酶溶液相当的酶活力?315

100 =357.96/100×315=1127.57u 15ml酶溶液的总活力u＝

糖化酶的比活力?酶粉质量?15

100 ＝19312/100*15=2896.8u 固定化酶的回收率ω％＝

330ml胶酶溶液相当于15ml酶溶液酶活力?100％

15ml原酶液的活力 ＝1127.57/2896.8×100％＝38.9%

5、固定化酶半衰期的测定

表4 固定化酶的半衰期测定表格 时间 质量g A B 酶活力 u/g Lg 活力 0 5 9.05 7.85 7.85 0.895 24 5 9.00 8.15 5.56 0.745 由下图得：t1/2=ln2/0.0068=110h（4天零14小时）

10.90.80.70.60.50.40.30.20.10051015202530y = -0.0063x + 0.895R2 = 1

图2 固定化酶半衰期的测定

七．结果与讨论：

本实验采用包埋法对糖化酶进行固定化并对其Km，半衰期t2/1重要参数进行测定，随着人们对天然高分子载体的不断挖掘和探究,对其进行改性,或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶,同时,开发新型、高效固定化酶反应器,进一步提高转化和生产能力是固定化酶技术发展的趋势。 以上实验得出实验数据如下： 项目 游离酶活 Km 固定化酶活 固定化酶半衰期 数据 19312U/g 0．267 mg/ml 误差分析：

（1）实验中要求采用的硫代硫酸钠溶液需放置三天才能使用，而我们没有做到这一点，这使结果发生偏差。

（2）由于在测固定化酶的活力过程中，固定化酶微球会浮在反应液表面，要使它们能与反应液均匀接触，要在反应过程中不断搅拌反应液，我们是隔一段时间去搅拌一次，而不是使它一直保持搅拌状态，所以测的结果有偏差。 （3）我们测定酶活的方法是采用滴定硫代硫酸钠法，由于我们操作的不够熟练，在滴定的过程中会多滴一两滴，这使我们的一些数据会偏大。

（4）测固定化酶活与固定化酶的回收率，没有在同一天做，固定化酶放置了一天，这使固定化酶的回收率测定出现偏差。

7．85 U/g 110h 固定化酶活力回收 38．9%

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