生化实验指导(9)

分钟

15kr/min离心10分钟，沉淀物用70％乙醇洗涤三次，在真空干燥器中快速干燥DNA，然后溶解在40μLddH2O中

取出4μLDNA，加入lμL RNase（浓度为200μg/ml），再加2μL溴酚蓝、蔗糖指示剂和3μLdH2O于室温15～30分钟后，点样电泳

3mol/L KAc (pH4.8)溶液的配制：加5mol/L醋酸钾60ml和冰醋酸11.5ml，加ddH2O至100ml。

3.在抽提过程中，步骤中提到将Eppendorf 翻转几次，并不是一个一个地翻转，可以在加好试剂后，盖紧，放在Eppendorf架子上一起翻转。

4.在碱变性SDS法，SET法中，反复地用较高浓度的TE缓冲液悬浮，再用乙醇沉淀，都是为了达到纯化DNA的自的，细胞的细胞壁及胞内的许多小分子，有抑制酶作用，往往靠酚、氯仿抽提是不够的，靠上述多次悬浮与沉淀也达到纯化的目的，尤为PEG沉淀效果最好。

5．在基因工程操作中，对DNA纯度要求最高的是用来作DNA序列分析模板，而用PEG6000或PEG8000沉淀都能得到纯度极高的质粒DNA，但是用PEG沉淀时有两点必须注意，一是要有一定盐离子浓度，常用4mol/L NaCl,二是通过离心后一定要把PEG去除干净。用微量过柱法纯化的样品纯度很高，可直接用作双链DNA序列分析。

七、思考题

1、碱变性法抽提质粒DNA原理是什么？

2、抽提质粒DNA时主要的污染杂质是什么，在电泳图上反映出来的现象是什么？ 八、参考文献

1、彭秀玲、袁汉英、谢毅、王洪海编著，基因工程实验技术（第二版），湖南科学技术出版社，1998，p29-36

实验五十 PCR扩增外源基因

一、目的要求

学习PCR技术的基本原理，了解影响PCR扩增效果的因素，掌握特定核苷酸序列体

外扩增的基本操作技术。

二、实验原理

(一) PCR技术的原理及运用

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外特定核苷酸序列扩增技术，具有操作简便、快速高效、特异性强、灵敏度高、重复性好等特点，在数小时内能轻易地将单个分子的DNA目的片段体外扩增几百万倍。

PCR技术的基本原理与细胞内发生的DNA复制过程相类似，是在特异引物介导下，由模板DNA、dNTPs、反应缓冲液、Mg2+、耐热TaqDNA聚合酶组成反应体系的一种酶促反应。人工合成的靶序列两端互补的寡核苷酸引物决定了PCR反应的特异性；两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短。典型的PCR由变性—退火—延伸三个基本步骤构成。

（1）变性 待扩增的双链模板DNA在接近沸点的高温（通常为93℃-94℃）下解链成两条单链。

（2）退火（复性）在适当的温度（50-60℃）下，2条寡核苷酸引物分别与两条目的序列两侧进行氢键配对，形成引物—模板杂交双链。

（3）延伸 耐热的DNA聚合酶（Taq酶）利用dNTPs，在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板以5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

上述三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA迅速扩增。

PCR技术广泛地应用于医学、法医学、药学、生物学、分子生物学、农学、生物医药工程及其相关学科的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成 cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因； (4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移；

(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

（二）PCR反应体系的组成与反应条件的优化

PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPs）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。

1. 引物

PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，引物是决定PCR结果的关键。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：

⑴ 引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量使全部碱基在引物寡核苷酸链中随机分布，避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列。

⑵ 引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不存在连续3个G或C，不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。

⑶ 引物5’端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加1—2个保护碱基。

⑷ 引物不与模板结合位点以外的序列互补；所扩增产物本身无稳定的二级结构。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个。

⑸ 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

⑹ 人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

⑺ 引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μmol），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用灭菌ddH2O配制成10μmol或20μmol的工作液。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2~1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体。过低则降低产量。利用紫外分光光度计可计算出引物的浓度。在1cm光程比色杯中，260nm下引物的浓度按下式计算：

Xmol/L=OD260/A（16000）+C70000）+G(12000)+T( 9600) X ：引物摩尔浓度；A、C、G、T：引物中4种不同的碱基数。

由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。 2. 四种三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）

dNTPs应用NaOH调pH至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。高浓度dNTPs易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μmol/L的dNTPs。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低，直接影响到反应的效果。

3. Mg2+

Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著的影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μmol/L时，Mg2+为1.5mmol/L较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+ 的浓度。一般以1.5-2mmol/L（终浓度）较好。

4. 模板

PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板浓度过高会影响PCR的结果。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白及残留酚等，将可能干扰PCR反应。

5. Taq DNA聚合酶酶

一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。TaqDNA聚合酶的活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTPs到核酸中所需的酶量。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

6. 反应缓冲液

标准缓冲液含：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl（pH8.3~8.8），1.5mmol/L MgCl2。Tris-HCl在20℃时的pH为8.3~8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8~7.8。KCl有利于引物的退火。

（三） PCR污染原因分析 1. 标本间交叉污染

标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

2. PCR试剂的污染

主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3. PCR扩增产物污染

这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样，都可形成气溶胶而产生污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

4. 实验室中克隆质粒的污染

在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。

三、仪器及器材 1. DNA扩增仪。 2. 电泳仪，电泳槽。

3. 紫外检测仪带照相机或凝胶成像系统。 4. 高速离心机。 5. 微量移液器。 6. Tip头。 7. Eppengorf管等。 四、试剂

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