生化实验指导(7)

蛋白质（μg） 加入蛋白试剂（mL） 光吸收值（A595）

0 4 20 4 40 4 60 4 80 4 10 40

（2）蛋白质含量的测定

取含10～100ug/ml蛋白质溶液1mL于小试管中，然后加入4mL蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595nm测定光吸收值。以1mL蒸馏水及4mL蛋白试剂作为空白对照。

表37-3 蛋白质含量的测定

管号

样液（mL） 蒸馏水（mL） 蛋白质（μg） 加入蛋白试剂（mL） 光吸收值（A595）

对照 0 1.0 0 4

样1 10~100 4

样2 10~100 4

样3 10~100 4

样4 10~100 4

样5 10~100 40

六、数据处理

1．计算SOD分离纯化过程中各步处理获得的酶液的酶的总活力

SOD活性的计算按下列公式计算。

1mL酶液中酶的活力＝ΔAA0?0.1?50%每步处理酶的总活力＝ΔA?VA0?0.1?50%ΔA：A0管的吸光度－各样品的吸光度； V：酶液总体积； A0：A0管的吸光度； 0.1：加入酶液的体积；

利用上述公式计算各步纯化过程获得的酶的总活力。 2．蛋白质标准曲线的计算

以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。 3．计算SOD分离纯化过程中各步处理获得的样液中蛋白质的总的含量

根据各样品的光吸收值，在标准曲线上查得对应的蛋白质的含量，根据测定过程中样液的用量及各步所得的总的体积计算出各提取阶段所得液体中蛋白质的总含量。 4．计算SOD分离纯化过程中各步处理获得的酶的比活力：

酶的比活力＝酶的总活力总蛋白质含量（mg)5．酶的回收率：指纯化过程中酶活力的收率。提纯后与提纯前酶的总活力的比值。

每次比活力 纯化倍数＝第一次比活力6．纯化倍数：指提纯后与提纯前酶比活力的比值。

回收率＝每次总活力?100

第一次总活力六、SOD分离纯化各步处理的结果及分析

将分离纯化过程中每步测得的数据及计算结果填入下表，并进行分析。

表37-4 SOD纯化各步结果

步骤

总体积 （mL）

总蛋白 (mg)

总活力 U

比活力 (U/mg)

活力回收率 （%）

纯化倍数

粗提液 硫酸铵沉淀 丙酮沉淀

DEAE纤维素离子交换层析

100

1

七、思考题

1．为什么在酶的分离纯化过程中，要测定各步处理的比活力，活力回收率和纯化倍数？ 2．根据本实验的结果，请评价硫酸铵沉淀、丙酮沉淀和DEAE纤维素离子交换层析各步处理的效果。

八、参考文献

1.张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验技术方法和技术（第2版），高等教育出版社，1997，p217-222

实验九 维生素C含量的测定-(2，6一二氯酚靛酚

法) 一、目的

学习维生素C的化学检测的原理和方法

二、原理

抗坏血酸(Vc)有还原型和氧化型两种。还原型具强还原性，可还原染料2，6-二氯酚靛酚钠盐，而本身转变成氧化型。氧化型的2，6-二氯酚靛酚钠盐在碱性条件下呈蓝色，在酸性条件下呈红色；还原型的2，6-二氯酚靛酚钠盐在酸性条件下无色。因而利用在酸性溶液中还原型氧化型这一明显色差，可用氧化型2，6-二氯酚靛酚滴定样品中的还原型抗坏血酸，当抗坏血酸全部被氧化后，稍后加一点2，6-二氯酚靛酚，滴定液就呈淡红色，即达终点，根据滴定消耗的2，6-二氯酚靛酚的量，可以确定样品中的还原型抗坏血酸的含量。

三、材料与器材

1．材料：猕猴桃，各种水果蔬菜均可。

2．器材：三角瓶(100mL)4个，研钵一只，移液管(10mL)4支、(1 mL )1支，容量瓶(100 mL)，微量滴定管，分析天平，离心机，漏斗，滤纸。

四、实验试剂

1．标准抗坏血酸溶液(0.1mg／mL)

抗坏血酸50mg溶于1%草酸溶液，用1%草酸溶液定容500 mL，贮于棕色瓶中，冷藏，临用现配。

2．1%草酸溶液：10g草酸溶于1000 mL 蒸馏水中。 3．2%草酸溶液：2g草酸溶于100mL 蒸馏水中。

4．0.1% 2，6－二氯酚靛酚溶液:将500mg 2,6-二氯酚靛酚溶于300mL含104 mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至500mL，过滤，贮于棕色瓶中，冷藏。(4℃可保存一周)

四、操作步骤

1.提取：将猕猴桃去皮，捣碎，称取1g研碎，加入2%草酸溶液少许，研磨成浆，转移至100mL容量瓶，用2%草酸溶液定容后过滤备用。

2．滴定：取4只三角瓶，编号1，2，3，4，按下表操作

表9 VC含量的测定

三角瓶编号

标准抗坏血酸溶液（0.1mg／mL）（mL） 1%草酸溶液（mL） 样品滤液（mL）

1 1.0 9.0 －

2 1.0 9.0 －

3 － － 10.0

4 － － 10.0

用0.1%2，6-二氯酚靛酚滴定消耗的mL数

空白对照与样品消耗的2，6-二氯酚靛酚的平均mL数

V样=

V空白=

用0.1%2，6-二氯酚靛酚滴定时，以滴定至出现微红色15秒保持不退色即为滴定终点。

五、数据处理：

100g样品中含抗坏血酸mg数?V样?T?100 WT—1 mL染料，相当于抗坏血酸mg数； 根据三角瓶编号为1、2的滴定结果： T=0.1?V空白

V样W—10 mL样液相当于样品的克数: W?上述有误，重新编制：

三角瓶编号

标准抗坏血酸溶液/mL 1%草酸溶液/mL 样品滤液/mL

消耗0.1% 2，6-二氯酚靛酚mL数 各处理消耗2，6-二氯酚靛酚平均数

10?25 250样品滴定 5 － － V3

6 － －

标准液滴定 空白滴定 1 1.0 9.0 － V1

2 1.0 9.0 －

3 － 10 － V2

4 － 10 －

10.0 10.0

100g样品中含抗坏血酸mg数=(V3-V2)×C×T*100/D/W V2：滴定空白对照消耗的染料的数量(mL)； V3：滴定空白样品消耗的染料的数量(mL)； C：样品提取液总体积(mL)；

D：滴定时所取的样品液的体积(mL)； W：待测样品所取的质量(g)

T：1 mL染料相当于抗坏血酸的mg数：T=0.1×1/V1

0.1：标准VC的浓度（mg／mL） 1：标准滴定所取的标准VC的量(mL) V1：标准滴定消耗的染料(mL)

六、分析讨论 七、思考题

1.为了准确测定维生素C的含量，在实验过程中应该注意哪些操作，为什么？

2.为什么在提取样品中的抗坏血酸时，加入的提取液是2%草酸溶液，而不是1%草酸溶液？

实验四十七 大肠杆菌感受态细胞的制备

一、实验目的

学习氯化钙法制备感受态细胞的方法。 二、实验原理

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

三、实验器材

台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，灭菌锅，快速混匀器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 mL微量离心管，双面微量离心管架，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。实验前把1.5 mL微量离心管装入铝制饭盒高温灭菌、移液器吸头装入相应的吸头盒高温灭菌，摇菌试管和三角烧瓶也要高温灭菌。

四、实验试剂

E. coli DH5?，0.1 mol/L CaCl2溶液（高压灭菌，121?C 30 min），无菌蒸馏水。 五、实验操作步骤

1. 取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2 mL LB（不含抗菌素）培养基。 2. 从超低温冰柜中取出DH5?菌种，取2 ?L菌液接入含2 mL LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。

3. 次日取0.5 mL上述菌液转接到含有50 mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250 rpm/min摇床培养2?3 h，测定OD590为0.375（<0.4?0.6，细胞数<108/mL，此为关键参数）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。

4. 将菌液分装到1.5 mL预冷无菌的Ep管中，于冰上放置10 min，然后于4℃，5000 rpm/min离心10 min。

5. 将离心管倒置以倒尽上清液，加入1 mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在快速混匀器上混匀，插入冰中放置30 min。

6. 4℃，5000 rpm/min离心10 min，弃上清液后，用1 mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，插入冰中放置30 min。

7. 4℃，5000 rpm/min离心10 min，弃上清液后，用200 μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬菌液，超净工作台中按每管100 ?L分装到1.5 mL离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入―80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

8. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 六、注意事项

1. 细胞生长状态和密度：最好从―70℃或―20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备

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