铁皮石斛RCA2基因克隆与生物信息学分析(2)

　　叶片总RNA提取后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，检测结果显示，28S和18S条带清晰，A260/A280值1.96，浓度为210.56ng·μL1。

　　以铁皮石斛叶片总RNA反转录的cDNA为模板，以兼并引物RCAF1和RCAR2进行保守区片段PCR扩增，得到一个503bp保守片段（图1：B），根据设计的3′端和5′端特异引物，采用RACE技术，扩增获得3′端目的片段（图1：D）和5′端目的片段（图1：C）。利用生物软件DNAMAN进行序列拼接得到该基因的全长为1730bp，利用ORFfinder分析，共有9个ORF，该基因最长的ORF共计1323bp，包含81bp的5′UTR、326bp的3′UTR，编码440个氨基酸，将该基因命名为RCA2，GenBank登陆号为KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2扩增获得1323bpORF片段（图1：A），连接到pGEMTEasy载体上测序验证，得到的阳性质粒命名为pGEMRCA2。

　　2.2RCA2基因全长的生物信息学分析

　　2.2.1RCA2核苷酸及编码蛋白序列的理化性质利用blastp和DNAMAN对RCA2氨基酸序列进行比对分析，发现该基因包含PloopNTPaseSuperfamily结构域，分别为“WGGKGQGKS”（A区）和“GKMCCLFINDLD”（B区），属于PloopNTPase超家族基因（图2）。理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53kDa，等电点为6.19。将该基因全长核苷酸序列在NCBI上进行blastn相似性比较，结果表明基因均为RCA基因，且与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达87%。氨基酸序列比对分析，发现其氨基酸序列与蝴蝶兰、葡萄、荷花的相似性分别为89%、84%、85%（图3）。

　　2.2.2RCA2编码蛋白质的亲疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的亲疏水性发现，RCA2蛋白质序列具有较高的亲水性，其中第69位的Thr亲水性最强（-3.078），第162位Leu的疏水性最强（2.122）（图4）。

　　2.2.3RCA2编码蛋白质的亚细胞定位蛋白的亚细胞定位与该蛋白所执行的功能是密切相关的，用TargetP和PSORTII软件进行亚细胞定位分析，TargetP预测结果显示RCA2蛋白定位于叶绿体基质，可信度为3（图5：A），用PSORTII预测蛋白显示，RCA2蛋白定位于叶绿体基质、线粒体基质间隙、叶绿体类囊体膜、叶绿体类囊体腔，RCA2蛋白主要存在于叶绿体基质（图5：B）。

　　2.2.4RCA2编码蛋白质的功能预测与分析利用ProtfunsoftwareofCBS分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类，可能有意义的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，他们的几率分别是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。这表明RCA2在中间代谢起到了一个非常重要的角色，在脂肪酸代谢、翻译中起到了重要作用，在辅酶因子的生物合成和能量代谢中也起到了关键作用。

　　2.2.5RCA2编码蛋白质的二级、三级结构预测采用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测，结果表明，α螺旋占30.68%，延伸链占25.45%，不规则折叠占43.86%（图6）。用ExPASy网站上的SWISSMODELWorkspace预测蛋白质的三维结构以4w5w.1.A（SMTLid）为模板进行建模，该模板以XRAY2.90方法产生，与RCA2蛋白一致性为86.02%（图7）。

　　3讨论与结论

　　该研究通过RTPCR和RACE技术方法，成功克隆了铁皮石斛RCA2基因（GenBank登录号KT205842）全长1730bp，开放阅读框1323bp，编码440个氨基酸；核苷酸序列分析结果表明，RCA2核苷酸序列与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达87%，其编码蛋白属于PloopNTPaseSuperfamily家族基因。蛋白理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53kDa，等电点为6.19，为亲水性蛋白，RCA2编码蛋白质的亚细胞定位于叶绿体基质；编码蛋白质的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，蛋白质三级结构预测模型与RCA2蛋白一致性为86.02%，这些生物学参数为进一步研究RCA2蛋白的酶学性质及其在铁皮石斛中的光合作用机理奠定了理论基础。

　　Rubisco作为光合速率的限制性因子，近些年已成为提高植物光合效率的研究目标之一，而RCA对维持Rubisco的净光合速率及初始羧化活力均有重要调节作用（张国等，2005）RCA自被Salvuccietal（2005）在拟南芥中报道以来，一直是农业生物工程研究关注的焦点。当RCA基因表达量降低时，植物的光合速率随之下降，生长也变慢，因此通过调控RCA的表达提高光合作用，最终实现植株产量的增加，将会有广泛及良好的前景（李海霞等，2010）。Rubisco活化酶能维持并调节植物Rubisco的活性，使Rubisco的活性位点因为与磷酸糖类物质的结合而导致活性降低的不利影响得到最大程度的抑制，且能够降低Rubisco去氨基甲酰化时所需CO2的浓度，显著提高Rubisco的活性，因此对调节植物光合速率有着直接作用（Portis，2003；Salvucci&CraftsBrandner，2004；Zhangetal，2002）。铁皮石斛是药用观赏植物，其RCA基因的分子克隆、生物信息学的研究，为研究其他药用观赏植物RCA基因的结构及功能提供了参考和借鉴价值，并为进一步研究Rubisco活化酶在铁皮石斛光合作用中的功能和分子调控机理奠定了基础，其进一步的相关研究工作正在進行中。

　　作者：蒋素华等

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