铁皮石斛RCA2基因克隆与生物信息学分析

　　摘要：核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶是光合碳同化作用的关键酶，它对调节铁皮石斛Rubisco活性和光合速率具有直接的作用，对其进行基因等方面的研究，会对改变植物光合速率打下良好基础。该研究以一年生铁皮石斛叶片为材料，采用RTPCR和RACE技术成功克隆了Rubisco活化酶（RCA）基因，并对其进行生物信息学分析。结果表明：RCA基因全长1730bp，命名为RCA2（GenBank登录号KT205842），其中5′UTR81bp、3′UTR326bp，开放阅读框1323bp，编码440个氨基酸，分子质量为48.53kDa，等电点为6.19，包含PloopNTPase超家族基因结构。氨基酸多重序列比对发现RCA2核苷酸序列与蝴蝶兰的相似性高达87%。RCA2编码蛋白为亲水性蛋白；亚细胞定位于叶绿体基质；蛋白质二级结构分析，α螺旋占30.68%，延伸链占25.45%，不规则折叠占43.86%。RCA2编码蛋白质的功能预测发现，RCA2在中间代谢起到了一个非常重要的角色。该研究发现对铁皮石斛光合作用关键酶Rubisco的分析可为其光合作用特性的发掘提供理论基础，并为提高温室大棚栽培效率提供理论依据。

　　关键词：铁皮石斛，RCA2基因，克隆，生物信息学分析

　　中图分类号：Q949.71

　　文献标识码：A

　　铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生的草本植物，铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、双苄酚类、菲酚类等多种药效成分，是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种，具有滋阴清热、润肺止咳、益胃生津、明目强身等作用（Zhangetal，2000）。核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco）是存在于叶绿体内的一个双功能酶，同时催化卡尔文循环中最初固定CO2的反应以及光呼吸作用中的第一步反应，该酶处于光合碳还原和碳氧化两个方向相反但又相互关联的循环交叉点上，对净光合速率起着決定性的影响，因此提高Rubisco活力是提高光合作用的重要途径（潘瑞炽等，2004）。因铁皮石斛原生地的生境破坏和常年的滥采乱挖，野生资源遭到严重的破坏，濒临灭绝，已列入中国珍稀濒危保护植物的名录。由于石斛不能够栽培在土壤里，北方地区必须栽培在树皮、木块、锯末等做的栽培床或者是石头上，冬天多数需要盖温棚等设施，投资较大，加上石斛种植的技术要求高，目前市场尚未完全打开，发展速度还不是很快（张明等，2010）。

　　随着生物技术的发展，许多粮食作物如大麦（Rundle&Zielinski，1991）、水稻（Toetal，1999）、大豆（Yinetal，2014）等植物的RCA基因被克隆，但目前报道的RCA基因很少有涉及药用观赏植物，最近有朱明库等（2013）对羽衣甘蓝Rubisco活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息学及表达分析的研究；袁秀云等（2016）对蝴蝶兰Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低温胁迫下的表达分析的研究；祝钦泷等（2011）对彩叶草Rubisco活化酶基因SsRCA进行了组织表达特异性和光诱导表达特性研究；曾淑华等（2012）已从铁皮石斛中克隆了光合碳途径关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此，开展铁皮石斛RCA基因研究显得尤为必要。本研究为了提高石斛的质量，提高石斛光合效率，揭示铁皮石斛光合作用机理自然成了铁皮石斛研究领域的重要问题，该研究利用RACE技术克隆出铁皮石斛RCA2全长基因，并进行生物信息学分析，为进一步研究铁皮石斛光合作用调节机理奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　铁皮石斛原产地为贵州，现在种植于河南省郑州市郑州师范学院兰花工程技术研究中心智能日光温室，植物材料为一年生铁皮石斛。

　　1.2方法

　　1.2.1RNA提取选取一年生铁皮石斛叶片，液氮速冻，保存于-80℃冰箱备用。叶片总RNA提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Tiangen公司）；采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性；采用QuawellQ5000微量紫外可见分光光度计测定其A260/A280值及其浓度。

　　1.2.2RCA2基因全长的克隆以提取的叶片总RNA为模板，用反转录试剂盒合成单链cDNA。根据GENBANK上已知植物的RCA保守区，利用DNAMAN和Primer5.0生物軟件设计兼并引物（表1），扩增RCA保守片段。PCR反应体系为20.0μL：10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMix2.0μL、上游引物RCAF1（10μmol·L1）1.0μL、下游引物RCAR1（10μmol·L1）1.0μL、模板cDNA1.0μL、rTaq酶（5U·μL1）0.2μL，加灭菌双蒸水至总体积20.0μL；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。切胶回收目的片段，连接pGEMTEasy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆送至上海英潍捷基生物技术公司测序，获得RCA基因的保守区序列。再根据获得的保守区序列，分别设计5′端和3′端特异性巢式引物（表1），以叶cDNA为模板，用巢式PCR方式分别扩增RCA的5′端和3′端序列，按Clontech公司SMARTerTMRACE扩增试剂盒操作说明进行反应，回收扩增目的产物，克隆到pGEMTEasy载体上，转入大肠杆菌DH5α菌株，进行测序和拼接。

　　1.2.3ORF的扩增根据DNAMAN软件拼接得到RCA基因序列全长，利用Premier5.0设计1对特异引物RCAF2和RCAR2（表1），用于完整开放阅读框（ORF）的扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环，72℃延伸15min。ORF片段连接到pGEMTEasy载体上，转化大肠杆菌DH5α，测序进行ORF序列验证。

　　1.2.4生物信息学分析利用ORFfinder进行开放阅读框的预测；利用NCBI上的BLAST进行基因相似性的分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）；利用DNAMAN进行氨基酸序列比对分析；利用ProtScale程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白质亲疏水性；利用TargetP软件（UsingPLANTnetworks）和PSORTll（http：//psort.hgc.jp/form.html）进行亚细胞定位的分析；利用Protfun（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类；利用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测；利用ExPASy网站上的SWISSMODEL进行蛋白质三级结构的预测分析。

　　2结果与分析

　　2.1RCA2基因全长克隆

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