间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植延缓骨骼肌萎缩(2)

A.MPC移植组；B.对照组；C.NSE表达阳性；D.NSE表达阴性（×200）

2.3　肌肉湿重及肌纤维横截面积维持率变化

术后2和4周， MPC移植组小鼠腓肠肌湿重、肌纤维横截面积维持率均显著高于神经断离组（n=6）（图2）。

2.4　组织学观察

2.4.1　HE染色

术后4 周，神经断离组骨骼肌细胞胞浆明显固缩，核内移现象普遍，细胞核变性（核染色质异染、缺失、核变小、甚至固缩）增多，染色加深，肌纤维排列紊乱，无方向性，肌纤维直径及横截面积明显缩小，胶原纤维明显增多。GFP-MPC移植组明显优于神经断离组，与对照组比较，肌纤维排列欠整齐，胞体偏小且大小不一，少量细胞仍可见细胞核变性现象，胶原纤维略有增加（图3 A、B、C）。

2.4.2　超微结构变化

术后4周，与神经断离组比较，GFP-MPC移植组细胞核明显增大、核质染色均匀，异染色质发达；线粒体数量增多，肿胀不明显，线粒体脊较多，形状相对正常；内质网扩张少；肌丝肌节排列整齐，横纹清晰，无明显的融合；肌纤维间隙胶原纤维量少；与对照组比较，GFP-MPC移植组细胞核明显增大，核仁增大且明显，异染色质发达，核内移动现象普遍，线粒体数量增多，但肌丝肌节形态偏小 (图3 D、E、F)。

2.5　肌动蛋白和肌球蛋白的表达

术后4周，MPC移植组肌动蛋白、肌球蛋白的表达强度显著高于神经断离组和对照组（n=6）（图4）。

2.6　RT-PCR检测Myogenin、MyoD基因表达

术后4周，MPC移植组MyoD的基因表达强度显著高于神经断离组及对照组，Myogenin基因表达强度显著高于神经断离组；对照组未发现明显Myogenin基因表达（n=6）（图5）。

3　讨论

尽管神经干细胞移植于受损的神经内或注入靶肌肉中均能有效延缓失神经性肌肉的萎缩，但其获得途径有限且扩增困难，因此寻找新的移植细胞仍然至关重要。新近研究发现，间充质祖细胞体外诱导分化来源的神经元及神经胶质样细胞移植于失神经支配靶肌肉中可原位定置存在，并能够很好地表达其移植前自身特性[7]。那么，从理论上推测：将间充质祖细胞源性神经元样细胞直接移植于失神经支配靶肌肉中，亦可能达到延缓骨骼肌萎缩作用，为此，我们进行了该方面研究。

我们研究发现：随着治疗时间的延长，小鼠右后肢活动功能逐渐恢复并接近正常；原位定植存活的移植细胞均匀分布于肌细胞间隙且部分细胞阳性表达神经元特异性标志物（NSE）；肌纤维、肌丝肌节的排列尚整齐且肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化的程度明显优于神经断离组，肌细胞形态与正常对照组较为接近；肌肉湿重、肌纤维横截面积维持率的下降幅度及α-actin、MHC的降解速度均显著低于神经断离组；这表明间充质祖细胞源性神经元样细胞靶肌内移植可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩，其治疗效果与MPC直接移植于神经离断处较为一致[9]；由于神经损伤，肌肉仍处于失神经支配状态，足量的神经营养作用的丧失致使骨骼肌最终走向萎缩的结局难以改变，但可以有效的为神经再生争取了时间，并可为神经再支配后肌肉功能恢复提供了更好的骨骼肌结构基础。

既往研究表明，肌卫星细胞(muscle satellite cells)是具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞或单能成肌干细胞，这种组织特异的祖细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起着重要的作用[10]，但肌卫星细胞的激活和成肌分化受MyoD家族的bHLH转录因子调控，其中MyoD决定着肌卫星细胞是否能激活成为具有成肌特性的肌肉干细胞，而Myogenin则发挥着调节肌肉干细胞终末分化为肌管肌纤维的功能[11]。此外，大量动物实验发现：成体骨骼肌一旦失神经支配,所有成肌调节因子的表达均上调,尤其是Myogenin 的高表达可启动一系列骨骼肌特异的胚胎性受体和收缩蛋白的合成,而这些胚胎性蛋白的表达是失神经骨骼肌接受神经再支配的必要前提[12]。本实验研究发现，术后4周，MPC移植组MyoD表达强度显著高于神经断离组和对照组，Myogenin基因表达强度显著高于神经断离组，对照组未发现Myogenin基因明显表达。因此，推测间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植延缓骨骼肌萎缩的可能机制是：定植存活的神经元样细胞分泌了骨骼肌所必需的某些神经营养因子，致使处于静止状态的肌卫星细胞被激活并成肌分化产生大量的新生肌纤维抑或直接抑制了肌细胞的萎缩，进而肌肉湿重、肌肉蛋白含量及肌纤维横截面积得以维持，但其具体作用机制仍有待进一步实验研究。

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参考文献

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［７］赵文勇,万立华,粟永萍.间充质祖细胞源性的神经元样细胞肌内移植后自身特性维持[J].第三军医大学学报,2013,35(8):744-749.

［８］赵文勇,王涛,王军平,等.肌肉特异性microRNAs在失神经肌肉萎缩中表达变化的研究[J].第三军医大学学报,2008,30(21):2034-2036.

［９］赵文勇,万立华,粟永萍,等.神经断离处移植间充质祖细胞延缓骨骼肌萎缩[J].基础医学与临床,2013,33(8):971-975.

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