黄酮标准曲线绘制的实验报告(2)

3.2.3标准曲线的绘制 3.2.2测试数据及标准曲线的绘制

序号 0 1 2 3 4 5 6

C（mmol/L）

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

吸光度 0.529 0.424 0.32 0.209 0.11 0.02

清除率/% 0 14.92 30.90 46.73 63.62 78.69 92.39

表3-1：VC标准曲线测定数据

以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。

图3-1：VC含量与吸光度的关系

图3-1：VC含量与清除率的关系

3.2.4样品的测定

取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释2.5倍。取稀释后溶液0.1mL三份,分别置于10mL 试管中，再分别加入配置好的DPPH溶液3.9mL,摇匀，反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以Vc为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品自由基清除率。

4. 清除ABTS+自由基能力的测定

4.1ABTS+自由基的配制

准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L；7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应12~16h，形成 ABTS+ 自由基储备液。该储备液在室温，避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm处测得其吸光度为0.7000（±0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。

4.2标准曲线的绘制

4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试

准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值，用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&Lian,2011)，用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×100%

式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS+ 自由基溶液的吸光度；

Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLABTS+ 自由基溶液的吸光度。

4.2.2测试数据及标准曲线的绘制

序号 C（mmol/l） 吸光度 清除率/%

1 0 0.00

2 0.1 0.57 12.04

3 0.2 0.493 23.92

4 0.3 0.422 34.88

5 0.4 0.351 45.83

6 0.5 0.276 57.41

7 0.6 0.2 69.14

8 0.7 0.118 81.79

9 0.8 0.035 94.60

表4-1：Vc浓度与吸光值和清除率的数据

图4-1Vc浓度与其吸光值的关系

图4-2：Vc浓度与其清除ABTS能力的关系

5.还原能力的测定

5.1实验试剂

磷酸盐缓冲溶液（配成PH6.6 0.2mol/l）; K3Fe(CN)6溶液（配成1%）; 三氯乙酸（配成10%）； FeCl3（配成0.1%）； 没食子酸 无水乙醇

5.2标准曲线的绘制 5.2.1试剂的配制

磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)：准确称取7.16g的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/L的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/L的磷酸二氢钠。准确量取37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)。 5.2.2标准溶液的配制及测试

用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50—300ug/ml，准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到0.5mg/ml的母液，在分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液，取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中，依次加入PH6.6磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/l）2.5ml和1% K3Fe(CN)6溶液2.5ml后混合均匀，混合液于50℃水浴20min,再加入10%的三氯乙酸2.5ml。于（3000r/min）离心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸馏水和0.1%的FeCl3 0.5ml混合均匀，静置10min在700nm处测定吸光值，通过在700nm下的吸收值来测量提取物的还原能力，吸光值越高表明还原力越强，EC50的计算是吸光值为0.5时的浓度（Roy&Laskar,2011）。

5.2.3测试数据及标准曲线的绘制

Test set

1 2 3 4 5 6 7

gallic acid concentration

ug/ml

0 50 100 150 200 250 300

Absorbency 0 0.59 1.1 1.527 2.073 2.579 3.1

表5-1：没食子酸的质量浓度和吸光值的数据

图5-1：没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系

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