细胞生物学实验报告(4)

（2）染色液与酵母样品液等量混合，染色5min。

（3）用血球计数板做水封片，显微镜下计数染色细胞与总细胞数。重复3次。 （4）细胞活性=活细胞数/总细胞数×100% 2、台盼兰染色步骤：

晃动悬浮培养物，稍静置，吸取上层悬浮液，在倒置显微镜下观察细胞，用缓冲液调到合适观察的细胞密度，加入几滴0.1％台盼兰溶液，用滴管混合均匀，5分钟后显微镜下观察，计数100个细胞的染色情况，重复3次，计算存活率。 3、TTC染色步骤：

（1）吸取振荡或静置培养的培养物8mL，以1000转/分离心10分钟。 （2）小心吸去上清液，加入0.4%的TTC溶液5mL混匀，30℃下染色1小时。 （3）在显微镜下观察细胞染色情况，比较两种培养物染色差异。 4、詹纳斯绿B染色步骤：

（1）吸取振荡或静置培养的培养物8mL，以1000转/分离心10分钟。 （2）小心吸去上清液，加入少量詹纳斯绿B 溶液混匀，30℃下染色30分钟。 （3）在显微镜下观察细胞染色情况，油镜下观察线粒体。比较两种培养物染色差异。

五、实验结果

1、美兰和台盼兰染色方法细胞存活观察

次数 1 处理方法 活细胞 美兰染色 死细胞 存活率% 活细胞 台盼兰染色 死细胞 存活率%

27 7 79.41 31 6 83.78 29 10 74.36 28 5 84.48 26 8 76.47 35 8 81.40 27.33 8.33 76.64 31.33 6.33 83.18 2 3 平均 16

2、振荡培养酵母TTC和詹纳斯绿B的细胞染色观察

六、作业与思考

1、美兰和台盼兰染色方法所得存活率差异原因探讨。

对于美兰染色，死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色；对于台盼兰染色，死细胞的细胞膜丧失活性或结构被破坏，胞膜的通透性增加，可被台盼兰染成蓝色。然而，在美兰染色中，可能存在部分活细胞由于还原酶活性相对较低，而不能完全脱色，因此会造成判定细胞死亡的假象，故美兰染色的细胞存活率较台盼兰染色的偏低。

2、酵母TTC和詹纳斯绿B染色差异的原因是什么？

对于TTC染色，在细胞的线粒体中四氮唑从电子传递链上接受电子形成三苯

詹纳斯绿B染色法

TTC染色法

基甲腙，其为脂溶性物质，形成后随即插入线粒体等膜中或脂滴中，变成红色。

对于詹纳斯绿B染色，由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色。

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综合性实验：细胞分裂中期纺锤体和染色体

结构荧光观察

一、实验目的：

1、学习和掌握细胞免疫荧光染色/细胞转染技术和荧光显微镜使用。 2、观察有丝分裂过程中染色体和细胞骨架的形态特征和动态变化。

二、实验原理：

有丝分裂是高等生物细胞增殖的主要方式。在有丝分裂过程中，细胞核内的染色体通过复制，形成姐妹染色体，在微管形成的纺锤体的牵引下，每一对染色单体分开，并向相反地方向运动，随后胞质分裂，最后形成两个完整的子细胞。通过有丝分裂，细胞形成两个与母细胞完全一样的子细胞，核内染色体经过准确地复制，并有规律地均匀分配到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞保持一致。

在细胞有丝分裂过程中，伴随着一系列事件的发生，比如基因组DNA的复制，染色体的形成，中心体移动到细胞两极，微管组装，纺锤体形成，核仁消失，核膜破裂等等。通过一定的细胞处理，可以将细胞阻滞在某个分裂阶段，再通过染色或标记，就能够观察和研究该阶段的细胞内部结构状态。

三、实验材料和仪器：

细胞培养间，超净工作台，细胞培养箱，倒置荧光显微镜，低速细胞离心机，水浴锅，冰箱，移液枪。高糖DMEM液体培养基，胎牛血清（FBS），0.25%胰酶消化液，PBS，200U/μl青链霉素储备液（P/S），0.2% 秋水仙碱，牛血清白蛋白（BSA），4% 多聚甲醛，75%酒精，TritonX-100，鼠抗α-Tubulin抗体，TRITC-羊抗鼠IgG抗体，DAPI染色液，抗荧光淬灭封片液。1ml, 200μl, 20μl枪头，15ml离心管，1.5ml离心管，12孔培养板，60mm细胞培养皿，圆形或方形盖玻片，载玻片，烧杯。

四、实验步骤：

1、细胞培养：

（1）Hela细胞培养：将解冻的Hela细胞转接到60mm培养皿中，加入4mL含有10?S和P/S 的高糖DMEM培养液，置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养。 （2）细胞爬片制备：

盖玻片准备：将盖玻片清洗干净后，浸泡在75%酒精中待用。实验前一天，将处理

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过的盖玻片放入12 孔板，放入超净台中，用紫外灯进行照射。待盖玻片附着的酒精完全挥发干后，进行细胞接种。

细胞接种：将胰酶消化的Hela细胞接种到放有处理好的盖玻片的12 孔细胞培养板中，再加入1ml新鲜完全DMEM培养液，震荡混匀后，放入37℃ CO2的细胞培养箱中进行过夜培养。或在盖玻片上滴加300μl适宜浓度细胞悬液，放入培养箱中过夜培养。 2、细胞处理：

细胞经过夜培养后，向每孔细胞培养液中加入适量秋水仙碱溶液，使终浓度达到0、2%，震荡混匀后，放入培养箱中进行培养3-5h。以未经秋水仙碱处理细胞作为对照。去除细胞培养液，细胞用PBS洗涤2次，然后用于免疫荧光染色。 3、免疫荧光染色

（1）每孔细胞加500ul 4% 多聚甲醛，室温固定20min。

（2）去除多聚甲醛，每孔细胞用500 ul含3% FBS或4% BSA 的PBS洗涤3次。 （3）每孔细胞用500ul含0.1% Triton X-100 的PBS在4℃透化处理10min。 （4）去除透化液，每孔细胞用1ml含3% FBS或4% BSA 的PBS室温洗涤5min。 （5）去除洗涤液，每孔细胞加入1ml含3% FBS或4% BSA的PBS，室温封闭30min-1h。 （6）去除封闭液，每孔加500 ul鼠抗α-Tubulin一抗稀释液（抗体用含3?S或4% BSA的PBS进行适宜稀释），室温孵育1h或4℃过夜。 （7）去除一抗，每孔细胞用1ml PBS洗涤3次，每次5min。

（8）每孔细胞加500 ul 带有TRITC（罗丹明）荧光标签的羊抗鼠IgG二抗稀释液（二抗同样用含3?S或4% BSA的PBS进行适宜稀释），室温孵育30 min-1h。 （9）去除二抗, 每孔细胞用1ml PBS洗涤3次，每次5min。

（10）去除洗涤液，每孔细胞加入少量适宜DAPI染色液，覆盖样品即可，室温孵育3-5min。 （11）去除DAPI染色液，每孔细胞用1ml PBS洗涤3次，每次5min。

（12）在载玻片上滴一小滴抗荧光淬灭封片液，将盖玻片从培养板中取出，面朝下盖到抗褪色剂上，使其轻轻接触到载玻片上。可在盖玻片周围滴几滴指甲油，以固定盖玻片。将玻片置于暗处5min使其晾干，然后在荧光显微镜下进行观察。 4、染色体和纺锤体荧光观察：

将制备好的样品放置在倒置荧光显微镜的载物台上，先用低倍镜在明场中找到细胞，观察细胞形态。然后打开汞灯，选择适宜滤光片，观察荧光标记的染色体和微管形态和结构。

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五、实验结果：

有丝分裂前期（紫外光）

有丝分裂中期（紫外光）

有丝分裂后期（紫外光）

有丝分裂前期（绿光）

有丝分裂中期（绿光）

有丝分裂后期（绿光）

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