枯草芽孢杆菌的研究与应用(2)

云金芽孢杆菌进行细胞融合获得了具有抑菌杀虫作 用的融合子CF103 ，田间试验结果显示，CF103 能兼治水稻纹枯病和稻纵卷叶螟，对照区病情指数为 49.8% 、虫害率为 41.5% ，而防治区分别为 0% ～36.9% 和1.7%～12.1%。陈中义等构建了含有 CrylAc 基因的两个穿梭表达质粒载体[14]，导入生防枯草芽孢杆菌B916，获得了兼有杀虫防病效果的基因工程菌Bs2014 和 Bs2249， 同 时 还 将 CrylAb 、 CrylAc 、Cry12Aa 等杀虫基因导入 B916 并获得了一系列单价和双价杀虫防病工程菌[15]。

3、枯草芽孢杆菌在现代科学研究中的应用

枯草芽孢杆菌 除主要用于其自身酶系和抗生素外，也用于作为表达系统和细胞质融合的研究 。

3．1 枯草芽孢杆菌表达系统的研究

自 1958 年 Spizizen 发现枯草杆菌 168 菌株能摄取外源基因以后，随着 DNA 重组技术的建立特别是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）带抗性标志的质粒可作为其载体的发现 ，枯草杆菌基因工程研究迅速发展。 芽孢杆菌作为原核表达系统与大肠杆菌表达系统有很大的区别，芽孢杆菌不能识别大肠杆菌的启动子，因此构建表达外源基因的枯草杆菌表达系统是研究者关注的问题 。 目前尚无商品化的枯草芽孢杆菌专用表达载体，为构建枯草芽孢杆菌的表达载体，获得枯草芽孢杆菌能够识别的启动子序列是首要条件。

陈晓月等根据 GenBank 中枯草芽孢杆菌的 P43启动子基因序列，设计合成了一对引物，用 PCR方法钓取枯草芽孢杆菌 AS．1655 菌株的 P43 启动子基因，PCR 产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，连接到pMD18T-simple 载体上，进行序列测定。测序结果表明，枯草芽孢杆菌 AS．1655 菌株的启动子全长427 bp ，由两个叠加的启动元件组成，分别为 σ55 和 σ37 RNA 聚合酶识别的位点，与 GenBank 中的和 σ37 RNA 聚合酶识别的位点，与 GenBank 中的枯草杆菌 P43 启动子的基因序列高度保守[16] 。 陈中义等分别以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭 RB- 质粒 pHB201 和 pRP22 为载体，通过感受态转化方 法，将 Bt HD21 杀虫蛋白基因 Cry1Ac 导入了水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌 B916[17] 。

3．2 枯草芽孢杆菌细胞质融合方面的研究

早在 1981 年，复旦大学的江行娟等就发现， 在 PEG 存在下，枯草杆菌 BD366 （pUB110）菌株和 -6 -4 G1 菌株的原生质体以10 ~10的融合率发生融合。 高温能使质粒 pUB110 消除，质粒消除后融合子的 菌落形态转变成为亲本 G1 的形态特征。他们认为双亲细胞融合后没有发生遗传重组，而是在分裂过程中发生分离，于是质粒 pUB110 可能出现在 G1细胞中，他们的试验为通过细胞

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融合的质粒转移和由于某一特定质粒的存在而改变菌落形态提供了初步证据[18]

。

上世纪 90 年代，唐文华等和刘伊强等将枯草芽孢杆菌与 Bt 通过细胞融合获得了具有抑菌杀虫 作用的融合子，从而使得该菌既有抗虫性又有抗药性，成为一种极有前景的农药制剂[19] 。

4.枯草芽孢杆菌应用中存在的问题

枯草芽孢杆菌的产业化应用 尚不成熟。首先是在医药方面，我们尽管已经证明 了枯草纤溶酶具有良好的溶血栓效果，但是在国内相应的商品化的药品却不多见。而且枯草脂肪酶用于制作相应的药物还不成熟，有待进一步研究。其次，在农业方面一些相应的生物农药和饲料也没有得到大范围的应用。这主要是由于科技的不均衡性和理论转化为实际的考察期较长造成的。枯草芽孢杆菌自身有需要克服的问题 。枯草芽孢杆菌虽然可以直接作用于农业来抗一些植物病虫害，然而，天然野生型微生物菌剂存在天生的不足 ，如产品持效期短、见效慢 、作

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用对象比较单一、易受自然环境影响、竞争存活能力有限等。 尽管枯草芽孢杆菌已经作为表达系统并在试验中应用，但是其自身具有的多酶体系使得转入它的外源质粒不太稳定，从而使其作为表达系统有一定的困难。

5.枯草芽孢杆菌制剂作用机理及应用效果

近年来抗生素由于存在药物残留和耐药性问题日益引起社会的重视，抗生素作为抗病促生长型饲料添加剂将会受到严格限制。在此情况下，既无残留问题也无抗药性问题的微生态制剂有了越来越广阔的前景，特别是随着相关科学试验的进行并取得了一系列的研究成果，微生态制剂的应用价值越来越被饲料厂家和养殖用户所肯定，其应用也更加广泛起来。其中，枯草芽孢杆菌的研究和使用发展最为迅速，现将其作用机理及应用效果作一浅谈。

5．1 枯草芽孢杆菌的作用机理

5．1．1 生物夺氧

早在 1996 年，研究动物微生态的科学家 Maruta K等就发现猪采食含 107cfu/g 枯草芽孢杆菌的饲粮 3 周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量显著下降，并且这种趋势在仔猪较母猪更明显。他们的研究表明：幼龄畜禽出生时，其消化道内通常是无菌的，出生后 3h 在胃肠道中可发现入侵的细菌，12h 后，可在大肠中检测到。按着需氧菌、兼性厌氧菌、严格厌氧菌的演替顺序，最终形成以乳酸杆菌、双歧杆菌等厌氧菌为优势菌群。芽孢杆菌为需氧菌，在生长过程中需要大量的氧气，进入动物肠道内，消耗大量的游离氧，降低了肠内氧浓度和氧化还原电势，改善了乳酸杆菌、双歧杆菌等厌氧菌的生长环境，有利于厌氧菌的生长，保持肠道微生态系统的稳衡，同时使肠道中原本存在的需氧菌肠杆菌等的生长因缺氧受到抑制，提高动物机体抗病能力，减少胃肠道疾病发生几率。

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5．1．1．1拮抗致病微生物，改善体内外生态环境

很多学者的研究证明动物饲喂芽孢杆菌后，能显著降低肠道大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌的数量，使机体内的有益菌增加而潜在的致病菌减少，因而排泄物、分泌物中的有益菌数量增多，致病性微生物减少，从而净化了体内外环境，减少疾病的发生。氨、胺、吲哚、硫化氢等物质在肠道粘膜对细胞有明显的毒害作用，芽孢杆菌抑制了有害微生物，进而减少有害物质产生，有利于动物健康和生长。陈兵（2002）研究 SD 大白鼠口服芽孢杆菌（枯草杆菌）1 周后粪便中厌氧菌群和需氧菌群的变化，结果表明肠道厌氧菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌、梭菌和拟杆菌数量均有不同程度增多，其中双歧杆菌从8.510±0.449 增加至 9.278±0.244（lgcfu/g）；而肠杆菌、肠球菌等需氧菌群数量则明显减少，肠杆菌从 8.213±0.426 减少到 7.709±0.372（lgcfu/g）。

5．1．1．2 增强动物体的免疫功能

近年的研究表明，芽孢杆菌能促进动物肠道相关淋巴组织处于高度的“免疫准备状态”，同时使免疫器官发育加快，免疫系统成熟快而早，T、B 淋巴细胞数量增多，动物体液和细胞免疫水平提高。Inooka 等（1986、1988）研究表明以 107cfu/g 剂量的枯草芽孢杆菌饲喂雏鸡时，将显著提高脾脏中 T、B 淋巴细胞量，但对脾脏中巨噬细胞活性没有影响。目前有学者认为：芽孢杆菌作为非特异性免疫因子，通过细菌本身或细胞壁成分刺激机体免疫细胞，使其激活，产生促分裂因子，促进细胞活力或作为佐剂发挥作用；此外，还可发挥特异性免疫功能，促进 B 细胞产生抗体的能力。大多数学者认同的观点是动物口服饲用芽孢杆菌后，调整肠道菌群，使肠道微生态系统处于最佳的平衡状态，同时各正常菌群包括口服的芽孢杆菌在肠道具有抗原识别部位的淋巴组织集合上发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜内的相关淋巴组织，使 SIgA 抗体分泌增强，提高免疫识别力，并诱导 T、B 淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫功能。

5．1．1．3产生多种消化酶

芽孢杆菌能提高动物生产性能是其产生多种消化酶的一个重要体现，这一点上枯草芽孢杆菌显得尤为突出。枯草芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶、葡聚糖、纤维素等酶，其中很多是动物本身不具有的酶。Popova 等（1995）研究发现分离得到两株枯草芽孢杆菌具有能分泌大量的细胞外酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶及卵磷脂酶。Kerovuo 等（1998，2000）成功地从枯草芽孢杆菌中分离出植酸酶基因，并将其在胚芽乳杆菌中进行表达。

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5．1．1．4产生多种营养物质

芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等，参与动物机体新陈代谢，为机体提供营养物质。Ozols等（1996）对从肠道中分离的 106 株菌研究后认为芽孢杆菌是动物体内维生素 B1 和 B6 的主要生产者。倪学勤等（1998）对 30 株饲用芽孢杆菌进行研究发现，分泌赖氨酸超过70mg/l 的菌株达 21 株。

5．2 枯草芽孢杆菌在动物生产上的应用效果

枯草芽孢杆菌制剂是一种无毒副作用、无残留的绿色饲料添加剂。其产品中含有的活菌是以内生孢子的形式存在的，能耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压，在配合饲料制粒过程中以及通过酸性胃环境时比较稳定。研究证明枯草芽孢杆菌进入动物肠道上段能够迅速萌发成具有新陈代谢作用的营养型细菌。这种营养型细菌在动物体内发挥诸多有益作用，能够提高动物的健康水平和生产性能。通过分泌多种消化酶，芽孢杆菌能够促进动物对饲料中营养物质的消化；通过分泌维生素及氨基酸等营养物质供动物利用，可以促进动物的生长；通过抑制动物体内的有害菌，可以起到预防动物疾病，优化养殖环境的作用。

5．2．1 禽类养殖中的效果

四川农业大学何明清教授主持国家“八五”科技攻关项目 -- 饲用微生物添加剂研究的验收报告（1995）中指出，芽孢杆菌 8901（家禽用枯草芽孢杆菌）添加剂经1993 ～ 1994 年 3 次结果进行统计分析，在中等营养水平的情况下，分别用 0.1%、0.15% 和 0.2% 的 8901 添加剂饲喂时间分别为 5、6、7 三种周龄的肉鸡，结果显示日增重较空白对照组分别提高 8.9%、14.5%、21.6%，饲料利用率分别提高 19.1%、17.9%、10.1%。安琪酵母集团动物营养研究室近期做的枯草芽孢杆菌在蛋鸡上的应用试验结果表明，添加 0.03% 福邦枯草芽孢杆菌制剂 ( 活菌总数 200 亿 / 克 ) 可使产蛋率提高 4.8%，破蛋率有很大改善，同时对产蛋高峰有一定的延长作用。

5．2．2 畜类养殖中的效果

仔猪断奶应激造成的消化吸收功能和机体免疫力下降是养猪业饲养过程中的普遍现象，尽管目前饲料厂家在饲料配制过程中添加了抗生素．但断奶仔猪的发病死亡率仍居高不下，四川农业大学潘康成教授的研究证明，在仔猪基础日粮中添加的枯草芽孢杆菌制剂，使试验组比对照组的头均日增重提高 3.92%，饲料转化率提高了5.96%, 腹泻率降低了 5%，净增重耗料成本降低了 4.61%。表明枯草芽孢杆菌制剂能促进仔猪消化，提高物质同化速度，提高饲料利用率，促进

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仔猪的生长速度，降低生产成本，提高猪的抗病能力，减少腹泻。在奶牛生产过程中，添加枯草芽孢杆菌制剂能通过生物夺氧扶持瘤胃内厌氧菌生长，维持瘤胃内微生态平衡、减少腹泻和预防疾病。目前在实际生产过程中常常根据有益菌的生物学作用及微生态特性 , 将芽孢杆菌与其他有益菌进行合理搭配，优化组合进行混合发酵制成复合菌种制剂并对不同种类的反刍动物、不同的生长阶段、不同的日粮水平应用不同的微生态制剂。四川农业大学王振华的试验研究结果表明枯草芽孢杆菌微生态制剂对奶牛的产奶量及奶成分均有一定的影响，在添加的初期阶段效果明显。反刍动物由于其瘤胃的特殊发酵方式，只有在有效活菌数量适宜时才能发挥最佳作用。他们的试验也表明，在奶牛产奶量提高，脂肪、蛋白质及非脂固形物也相应提高的情况下，饲喂奶牛枯草芽孢杆菌制剂的最佳活菌数为 2×1010cfu/d/ 头，而且在泌乳开始添加时效果较好。

5．2．3 在水产生产上的应用效果

在水产生产上，常常利用枯草芽孢杆菌对水产养殖环境进行修复，来达到优化养殖环境，预防疾病和提高生产性能的目的。将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)投放到水产养殖池中，作用菌沉于池底后，快速繁殖并分解或转化残饵、粪便等有机污染物，修复水产养殖环境，为养殖动物营造一个良好的生长栖息环境。淮海工学院海洋学院闫斌伦教授在全海水河蟹育苗阶段，使用活菌制剂的池水比对照池水中氨氮降低39.44%，亚硝酸氮降低 37.5%，提高幼体变态率 10 个百分点，换水量减少 80%，减少用药量 50% 以上。 黄海水产研究所刘淇教授采用半静水药浴法对南美白对虾养殖水体投放活菌制剂后，结果显示：①试验组平均体重略大于对照组；②枯草芽孢杆菌对养殖水体细菌总数无明显影响；③试验组透明度比对照组高38.21%；④ COD 试 验 组 低 于 对 照 组 24.5%；⑤ NH4-N试验组低于对照组 28.15%。此外，枯草芽孢杆菌制剂在河鲀、黄鳝、甲鱼生产上的应用也有很多研究都表明，养殖水体中使用枯草芽孢杆菌活菌制剂后，可明显降低富营养化程度，改善水质，因而可以降低病害的发生，提高水产品品质，而且降低能耗和成本。

综上可见，枯草芽孢杆菌在动物养殖中的作用机理已经越来越明晰，其作用效果也逐步得到了确证。因而可以预见，随着包括枯草芽孢杆菌制剂等绿色安全添加剂在动物生产上的广泛使用，人们也必将享受到越来越安全的美食，其社会意义也必将与经济意义双赢。

6.展望

尽管枯草芽孢杆菌在应用中存在一些问题，但是人们也在不断地研究克服其缺点的方法，例如陈乃用早在 1993 年就详细地分析了枯草芽孢杆菌的质粒稳定性问题，并提出了一些相应的解决措施 ，可以说枯草芽孢杆菌成为像大肠杆菌那样成熟的表达系统只是时间问题 。同时枯草芽孢杆菌中的其他酶，如淀粉酶

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