生化答案(4)

3.70×10-4 1.85

[（a）第一个方程两边各乘（1+Ka [L]），然后两边各除以[L]，并重排第2个方程；（b）根据第二方程，N/[L]对N作图的斜率是-Ka，N/[L]=0时的截距给出n。利用数据作图得Ka =2.2×10-4 mol/L，n=2.1。因为结合部位数目只可能是整数，所以n=2]

10.一个典型的松弛肌节中细丝长约2μm，粗丝长约为1.5μm。 （a） 估算在松弛和收缩时粗丝和细丝的重叠情况。

（b） 一次循环中肌球蛋白沿细丝滑行“一步”移动约7.5nm，问一次收缩中每个肌动蛋白纤维需要进行多少个步？ [（a）约0.75nm，（b）约67步] 解：（a）根据P281图6-35A所示， 当松弛是重叠总长度为：（1+1）-（3-1.5）=0.5μm 0.5/2=0.25μm 当收缩时重叠总长度为：（1+1）-（2-1.5）=1.5μm 1.5/2=0.75μm （b）（3-2）÷2×103÷7.5≌67步

第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 提要

蛋白质也是一种两性电解质。它的酸碱性质主要决定于肽链上可解离的R基团。对某些蛋白质说，在某一pH下它所带的正电荷与负电荷相等，即净电荷为零，此pH称为蛋白质的等电点。各种蛋白质都有自己特定的等电点。在等电点以上的pH时蛋白质分子带净负电荷，在等电点以下的pH时带净正电荷。蛋白质处于等电点时溶解度最小。在无盐类干扰情况下，一种蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH是它的真正等电点，称为等离子点，它是该蛋白质的特征常数。

测定蛋白质相对分子质量（Mr）的最重要的方法是利用超速离心机的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系数（s）的定义是单位离心场强度的沉降速度。s也常用来近似地描述生物大分子的大小。凝胶过滤是一种简便的测定蛋白质Mr的方法。SDS-聚丙乙酰胺凝胶电泳（PAEG）用于测定单体蛋白质或亚基的Mr。

蛋白质溶液是亲水胶体系统。蛋白质分子颗粒（直径1～100nm）是系统的分散相，水是分散介质。蛋白质分子颗粒周围的双电层和水化层是稳定蛋白质胶体系统的主要因素。

分离蛋白质混合物的各种方法主要根据蛋白质在溶液中的下列性质：（1）分子大小；（2）溶解度；（3）电荷；（4）吸附性质；（5）对配体分子特异的生物学亲和力。透析和超过滤是利用蛋白质不能通过半透膜的性质使蛋白质分子和小分子分开，常用于浓缩和脱盐。密度梯度离心和凝胶过滤层析都已成功地用于分离蛋白质混合物。等电点沉淀、盐析和有机溶剂分级分离等方法常用于蛋白质分离的头几步。移动界面电泳、各种形式的区带电泳，特别是圆盘凝胶电泳、毛细血管电泳以及等电聚焦具有很高的分辨率。纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂的离子交换柱层析已广泛地用于蛋白质的分离纯化。HPLC和亲和层析法是十分有效的分离纯化方法。 蛋白质制品的纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，例如PAGE、等电聚焦、毛细血管电泳、沉降分析和HPLC等。如果制品是纯的，在这些分析的图谱上只呈现一个峰或一条带。必须指出，任何单独鉴定只能认为是蛋白质分子均医性的必要条件而不是充分条件。 习题

1.测得一种血红素蛋白质含0.426%铁，计算最低相对分子质量。一种纯酶按重量计算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸的分子质量都是2.48%，问其最低相对分子质量是多少？[13110；15870] 解：（1）蛋白质MV=55.8÷0.426%=13100

（2）亮氨酸和异亮氨酸的分子质量都是131Da，根据两种氨基酸的含量来看，异亮氨酸：亮氨酸=2.48%：1.65%=3：2，所以在此蛋白质中的亮氨酸至少有两个，异亮氨酸至少有三个，那么：1.65%=2×（131-18）÷蛋白质MV 蛋白质MV=14581Da。

2.超速离心机的转速为58000r/min时，（1）计算角速度ω，以rad/s表示；（2）计算距旋转中心6.2cm处的离心加速度a；（3）此离心加速度相当于重力加速度“g”的多少倍？

[（1）ω=6070.7rad/s （2）a=2.284×108cm/s2；（3）a=233061g] 解：（1）ω=58000×2π/60=6070.7rad/s （2）a=（6070.7）2×6.2=2.285×108cm/s2 （3）2.285×108/9.8=23316326

3.一种蛋白质的偏微比容为0.707cm2/g,当温度校正为20℃，溶剂校正为水时扩散系数（D20.W）为13.1×10-7cm2/s.沉降系数（S20.W）为2.05S。20℃时水的密度为0.998g/ cm3,根据斯维德贝格公式计算该蛋白质的相对分子质量。[13000] 解：Mr=(RTs)/[D(1-υρ)]=8.314×（273+20）×2.05/[13.1×10-7（1-0.707×0.998）]=13000

4.一个层析柱中负顶相体积（Vs）为流动相体积（Vm）的1/5。假设某化合物的分配系数，（a）Kd=1；（b）Kd=50。计算该化合物的有效分配系数（Keff），也称容量因子（capacity）。[（a）Keff=0.2；(b)Keff=10]

5.指出从分子排阻层析柱上洗脱下列蛋白质时的顺序。分离蛋白质的范围是5000到400000；肌红蛋白、过氧化氢酶、细胞色素C、肌球蛋白、胰凝乳蛋白酶原和血清清蛋白（它们的Mr见表7-4）。[肌球蛋白、过氧化氢酶、血清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原、肌红蛋白、细胞色素C]

6.由第5题所述的，从分子排阻层析柱上洗脱细胞色素C、β-乳球蛋白和血清红蛋白时，其洗脱体积分别为118、58、37和24ml，问未知蛋白的Mr是多少？假定所有蛋白质都是球形的，并且都处于柱的分级分离范围。[52000]

7.在下面指出的pH下，下述蛋白质在电场中相哪个方向移动，即向正极、负极还是不动？（根据表7-2的数据判断。）（1）血清蛋白，pH5.0；（2）β-乳球蛋白，pH5.0和7.0；（3）胰凝乳蛋白酶原，pH5.0、9.1和11。[（1）正极；（2）负极、正极；（3）负极、不动、正极] 解：（1）卵清蛋白pI=4.6，pH=5.0>4.6 带负电，向正极移动； （2）β-乳球蛋白pI=5.2，pH=5.0<5.2 带正电，向负极移动； pH=7.0>5.2 带负电，向正极移动；

（3）胰凝乳蛋白酶原pI=9.1，pH=5.0<9.1 带正电，向负极移动； pH=9.1=pI 净电荷为零，不移动；

pH=11>9.1 带负电，向正极移动；

8.（1）当Ala、Ser、Phe、Leu、Arg、Asp和His的混合物在pH3.9进行纸电泳时，哪些氨基酸移向正极？哪些氨基酸移向负极？（2）纸电泳时，带有相同电荷的氨基酸常有少许分开，例如Gly可与Leu分开，试说明为什么？（3）设Ala、Val、Glu、Lys和Thr的混合物pH为6.0，试指出纸电泳后氨基酸的分离情况。 PI值：Ala：6.02 Ser：5.68 Phe：5.48 Leu：5.98 Arg：10.76 Asp：2.97 His：7.59 [（1）Ala、Ser、Phe和Leu以及Arg和His向负极，Asp移向正极；（2）电泳时，具有相同电荷的较大分子比较小分子移动得慢，因为电荷/质量之比较小，因而引起每单位质量迁移的驱动力也较小。（3）Glu移向正极，Lys移向负极,Val、Ala和Thr则留在原点。]

9.凝胶过滤层析和凝胶电泳中的分子筛效应有什么不同？为什么？

10.配制一系列牛血清清蛋白（BSA）稀释液，每一种溶液取0.1ml进行Bradford法测定。对适当的空白测定595nm波长处的光吸收（A595）。结果如下表所示： BSA浓度（mg?L-1） A595 1.5 1.4 1.0 0.97 0.8 0.79 0.6 0.59 0.4 0.37 0.2 0.17

BSA浓度对A595作图得标准曲线。E.coli的蛋白质提取液样品（0.1ml）测得的A595为0.84。根据标准曲线算出E.coli提取液中的蛋白质浓度。[0.85mg/ml] 解：标准曲线略。由标准曲线可知，当A595为0.84时，BSA浓度为0.85mg/ml。

第八章 酶通论 提要

生物体内的各种化学变化都是在酶催化下进行的。酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。与一般催化剂相比有其共同性，但又有显著的特点，酶的催化效率高，具有高度的专一性，酶的活性受多种因素调节控制，酶作用条件温和，但不够稳定。

酶的化学本质除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白质。根据酶的化学组成可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质是由不表现酶活力的脱辅酶及辅因子（包括辅酶、辅基及某些金属离子）两部分组成。脱辅酶部分决定酶催化的专一性，而辅酶（或辅基）在酶催化作用中通常起传递电子、原子或某些化学基团的作用。

根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为六大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。按规定每种酶都有一个习惯名称和国际系统名称，并且有一个编号。

酶对催化的底物有高度的选择性，即专一性。酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性两种类型。用“诱导契合说”解释酶的专一性已被人们所接受。

酶的分离纯化是酶学研究的基础。已知大多数酶的本质是蛋白质，因此用分离纯化蛋白质的方法纯化酶，不过要注意选择合适的材料，操作条件要温和。在酶的制备

过程中，没一步都要测定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯的效果。酶活力是指在一定条件下酶催化某一化学反应的能力，可用反应初速率来表示。测定酶活力及测酶反应的初速率。酶活力大小来表示酶含量的多少。

20世纪80年代初，Cech和Altmsn分别发现了某些RNA分子具有催化作用，定名为核酶（ribozyme）。有催化分子内和分分子间反应的核酶。具有催化功能RNA的发现，开辟了生物化学研究的新领域，提出了生命起源的新概念。根据发夹状或锤头状二级结构原理，可以设计出各种人工核酶，用作抗病毒和抗肿瘤的防治药物将会有良好的应用前景。

抗体酶是一种具有催化能力的蛋白质，本质上是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。根据酶催化的过度态理论，设计各种过度态类似物作为半抗原免疫动物，筛选具有催化活性的单抗。抗体酶具有酶的一切性质。现已研制出催化多种反应的抗体酶。抗体酶的发现，不仅为酶的过度态理论提供了有力的实验证据，而且抗体酶将会得到广泛的应用。

酶工程是将酶学原理与化学工程技术及基因重组技术有机结合而形成的新型应用技术，是生物工程的支柱。根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。随着化学工程技术及基因工程技术的发展，酶工程发展更为迅速，必将成为一个很大的生物技术产业。 习题

1.酶作为生物催化剂有哪些特点？

答：酶是细胞所产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般非生物催化剂相比较有以下几个特点：1、酶易失活；2、具有很高的催化效率；3、具有高度专一性；4、酶活性受到调节和控制。

2.何谓酶的专一性？酶的专一性有哪些？如何解释酶作用的专一性？研究酶的专一性有何意义？

答：酶的专一性是指酶对催化的反应和反映物有严格的选择性。酶的专一性分为两种类型：1、结构专一性，包括绝对专一性、相对专一性（族专一性或基团专一性、键专一性）；2、立体异构专一性，包括旋光异构专一性、几何异构专一性。

通过对酶结构与功能的研究，确信酶与底物作用的专一性是由于酶与底物分子的结构互补，诱导契合，通过分子的相互识别而产生的。 对酶的专一性研究具有重要的生物学意义。它有利于阐明生物体内有序的代谢过程，酶的作用机制等。

3.酶的活性受那些因素调节，试说明之。 答：酶的调节和控制有多种方式，主要有：

（1） 调节酶的浓度：主要有2种方式：诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解；

（2） 通过激素调节酶活性、激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性；

（3） 反馈抑制调节酶活性：许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质合成的第一步的酶，往往被他们终端产物抑制； （4） 抑制剂和激活剂对酶活性的调节：酶受大分子抑制剂或小分子物质抑制，从而影响酶活性； （5） 其他调节方式：通过别构酶、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶活性。

４.辅基和辅酶有何不同？在酶催化反应种起什么作用？

答：辅酶通常指与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质。通过透析方法可以除去，如辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ等。辅基是以共价键和脱辅酶结合，不能通过透析除去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白分开，如细胞色素氧化酶中的铁卟啉，丙酮氧化酶中的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）都属于辅基。它们的区别只在于它们与脱辅酶结

合的牢固程度不同。辅酶、辅基在酶催化反应中通常是起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。

５.酶分哪几大类？举例说明酶的国际系统命名法及酶的编号。

答：国际酶学委员会根据酶所催化反应的类型，把酶分为６大类：即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别利用1、2、3、4、5、6来表示。例如：1.1.3表示氧化还原酶，作用于CHOH基团，受体是分子氧。根据底物中别所用的基团或键的特点将每一大类分为若干亚类，每一个亚类又按顺序变成1、2、3……等数字；每一个亚基可再分亚亚类，仍用1、2、3……编号，每一个每的分类编号由4个数字组成，数字间由由“?”隔开。第一个数字指明该酶属于哪一个亚类；第三个数字指出该酶属于一个亚亚类；第四个数字则表明该酶在亚亚类中的排号。编号之间冠以EC（Enzyme Commision）。

6.什么叫酶的活力和比活力？测定酶活力应注意什么？为什么测定酶活力时以测定初速率为宜，并且底物浓度远远大于酶浓度？

答：酶活力指酶催化某一化学反应的能力，其大小可用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示；酶的比活力代表酶的纯度，根据国际酶学委员会的规定比活力用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示。

酶的催化作用受测定环境的影响，因此测定酶活力要在最适条件下进行，即最适温度、最适pH、最适底物浓度和最适缓冲离子强度等。只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力的大小。

随时间的延长，酶促反应中底物浓度降低，产物浓度增加，加速逆反应的进行，产物对酶抑制或激活作用以及随时间的延长引起酶本身部分分子失活等，酶促反应速率降低，因此测定活力，应测定酶促反应的初速率，从而避免上述种种复杂因素对反应速率的影响。

底物浓度太低时，5%以下的底物浓度变化实验上不易测准，所以在测定酶的活力时，往往使第五浓度足够大，这样整个酶反应对底物来说是零级反应，而对酶来说却是以及反应，这样测得的速率就比较可靠地反映酶的含量。

7.什么叫核酶和抗体酶？它们的发现有什么重要意义？

答：具有催化功能的RNA叫核酶。它的发现，表明RNA是一种既能携带遗传信息又有生物催化功能的生物分子。因此很可能RNA早于蛋白质和DNA，是生命起源中首先出现的生物大分子，而一些有酶活性的内含子可能是生物进化过程中残存的分子“化石”。酶RNA的发现，提出了生物大分子和生命起源的新概念，无疑促进对生物进化和生命起源的研究。

抗体酶是20实际80年代后期才出现的一种具有催化能力的蛋白质，其本质上是免疫球蛋白，但是在易变区被赋予了酶的属性，所以又称“催化性抗体”，抗体酶的发现，不仅为酶的过渡态理论提供了有力的实验证据，而且抗体酶将会得到广泛的应用。

8.解释下列名词：

（1） 生物酶工程：酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。

（2） 固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的、但仍具有酶活性的状态。 （3） 活化能：在一定温度下1mol底物全部进入活化状态所需要的自由能（kj/mol） （4） 酶的转化数：在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。 （5） 寡聚酶：由两个以上亚基组成的酶。

（6） Kat单位：在最适条件下，酶秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，为Kat单位。

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