微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案
一、重测序原理
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
二、技术路线
培养至对数期的单一菌落
↓基因组DNA提取 细菌DNA（纯化）
↓超声波打断 DNA片段化
↓ 文库构建
↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES
↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序 ↓
生物信息学分析
DNA片段化 ↓ 末端修复 ↓纯化 接头连接、缺口修复 ↓纯化 文库片段筛选（E-Gel法） ↓ 文库片段扩增 ↓纯化 Agilent Test、Qubit定量 ↓ Ion OneTouch System 重测序 三、实验方案 1.细菌总DNA的提取
液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA量。
细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。 取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。
2.DNA片段化
采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断 步骤：
1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg
2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色
3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE至总体积为50mL
4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中（200bp规格），转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子
5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”
6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中
3.末端修复及接头连接 3.1 末端修复
使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤：
1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min
3.2 片段纯化
片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行 步骤：
1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min
2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上
3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步
5）用20μL墙头小心吸去多余的液体
6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min
7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合
8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠） 9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接
4.接头连接、缺口修复和纯化
片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头 4.1 接头连接
在0.2mL体系中加入（以100ngDNA为例） DNA 25μL 10×Ligase Buffer 10μL Ion P1 Adaptor 2μL Ion Xpress Barcode X+ 2μL dNTP Mix 2μL Nuclease-free water 49μL DNA Ligase 2μL Nick pair polymerase 8μL Total 100μL
将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增 25℃ 15min
72℃ 5min 4℃ hold 循环×1
立即转移至一个新的1.5mL离心管中 4.2 纯化
片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行 步骤：
1）加入140μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min
2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上
3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步
5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体 6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min
7）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合
8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）
5.文库片段筛选
方案1
E-Gel Agarose System
采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。
主要步骤：
1. 上胶 将E-Gel系统包含的2%Agarose凝胶安装到基座上
2. 点样 胶孔内加入250ng的DNA Ladder、1μg DNA文库 3. 电泳 打开电源，设置电泳时间，开始电泳
4. 片段回收 根据Ladder选择需要回收的片段切胶回收 5. 片段纯化 方案2
采用琼脂糖凝胶电泳，胶回收法 步骤：
制备1%琼脂糖凝胶
1）称取0.7g琼脂粉置于锥形瓶中，加入70mL 1×TAE
2）锥形瓶放置于微波炉中加热至融化，取出，将融化的凝胶转移至凝胶区专用的100mL小烧杯中，向小烧杯中加入35μL 0.5μL/mL的EB（或其他染色物，如goldview，duRed等，使用浓度和用量各不相同）
3）将染液充分混匀，倒入装有制胶板且插上了梳子的胶槽中，待凝胶冷却后，轻轻拔下梳子，将装有凝胶的制胶板放入到电泳槽中，其中电泳槽内装有1×TAE缓冲液，没过胶约1~2mm
4）加样。向装有20μL的片段化DNA离心管中加入2μL的6×loading buffer，将离心管内的DNA溶液转移到胶孔中，同时在于凝胶间隔的位置点入3~5μL DL 1000 marker
5）120V电泳15~20min，蓝色条带到距离另一侧边缘1~2cm时停止电泳 6）将凝胶放置到切胶仪上，在紫外灯下迅速将200bp左右的片段切胶回收 7）使用胶回收试剂盒，按照说明书操作步骤，实现200bp左右大小文库片段的筛选
6.文库片段扩增 6.1 100ng文库PCR体系
扩增采用Ion Plus Fragment Library Kit 体系包括：
Platinum PCR SuperMix High Fidelity 100μL Library Amplification Primer Mix 5μL
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