原位杂交实验问题收集(2)

-------文献上用的5·和3·双标的Exiqon探针，我没有钱，所以用的是5·单标的探针！这顶多会比别人染色差一点，也不至于一点染色也没有！

关于棕色染色的问题，我以前做的时候，两三个小时就开始染出了蓝色，可是后来再也做不出这样的结果了！后来我也照文献终止染色后用甲醇梯度脱水后，发现去掉了不少背景，而且也变成了蓝色！总感觉这实验不是这样做的！------不要常温显色过夜，如果这样，肯定是全黑。你可以尝试4度过夜看看。如果实在不行，你就问文献的作者要他们的探针。-----拿甲醇去除背景后是下面的情况:

⑺你的显色应该是过度了 颜色太深 了；建议开始显色时每15分钟或者10分钟观察一次。我做过斑马鱼的整体原位杂交，从48h到7天的都做过，我个人觉得这个实验很重要的一部就是蛋白酶消化，但是你的基因是在体表表达，消化时间应该掌握很短，还有只要探针没问题，其他的步骤只要按照protocol来基本上是没问题的！------探针应该没有问题，之前就用这些探针做出来过，只是现在再也做不出来了，太奇怪了！做出来那次是染色的时候可能也就２个小时就显蓝了，而现在怎么都不显色，常温过夜后，到处都是，背景很深，用甲醇洗过后才可以看部分特异的染色！而我现在根本找不到那两次能做出来的原因，更不用说做不出来的原因了！

考虑过了，首先应该不是探针的问题，其次消化的问题应该也不会太大，因为是在体表表达的东西，穿透应该很简单吧！现在唯一能想到的就是杂交的温度问题，可是我的温度与之前做出来那次温度没有差别啊！还有会不会是PFA的问题，文献都说要用新鲜的ＰＦＡ固定组织，这个关系是不是很大？-------

⑻我们实验室的protocol是显色完全后用75%的乙醇脱色，请教楼主，跟甲醇脱色有什么区别吗？那种的效果好啊？用甲醇脱色一般是多久？也需要过半小时或者一小时的去换液

吗？--------应该没有什么区别--------我就是按照protocol做的，一般都会出，主要我都是做24h之前的，比较好做吧。。但是我不会照相啊。。不会调显微镜，每次照相都很郁闷。。。照出来的照片很难看。。。-------照相比较简单，但调显微镜的确很重要！用DIC照出来的效果会漂亮很多-------小鱼不产卵。。。做的原位杂交表达的特别怪异。。。一般用来做杂交的胚胎都是需要最近1个月之内的是吧？

⑼个人觉得你的鱼消化有点不够，那个全身棕色的情况我见过，建议你延长一下预杂交的时间，然后增加探针浓度做一下看看。 ⑽

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