质量源于设计(QbD)在原料药稳定性研究中的应用—头孢克肟原料药(5)

第三章 实验方法

3.1实验试剂及实验仪器

3.1.1实验试剂

表3-1 头孢克肟实验试剂

试剂 克肟甲酯 碳酸氢钠 氢氧化钠 盐酸 丙酮 乙腈 活性炭 EDTA-2Na

纯度 内控指标 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 药用 分析纯

生产厂家 自产

天津市永大化学试剂有限公司 天津市永大化学试剂有限公司 天津市永大化学试剂有限公司

北京化工厂

天津市永大化学试剂有限公司

日本白鹭

天津市永大化学试剂有限公司

3.1.2实验仪器

表4-2 头孢克肟实验仪器

仪器名称 电动搅拌器 手持在线pH计 低温恒温槽 真空干燥箱 电子天平 水分仪 稳定性试验箱 高效液相色谱仪 恒温水浴锅 真空泵

型号 JJ-1 SG2 DLSB-5/40 DZF-6050 JM31001 870 YSEI 1220 DK-98-ⅡA SHB-3

生产厂家

江苏金坛荣华仪器制造有限公司

Mettler Toledo

巩义市予华仪器有限责任公司 上海博讯事业有限公司医疗设备 余姚纪铭称重校验设备有限公司

Mettler Toledo 重庆市永生实验仪器厂

Agilent

天津市泰斯特仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司

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3.2原料药稳定性研究方法

3.2.1稳定性研究方法

有关稳定性研究的实验方法，在化学药物稳定性技术指导原则中分为三类即长期试验、影响因素试验和加速试验。而影响因素试验又分为高温、高湿和光照试验。影响因素试验进行的条件一般均为相对剧烈条件，以了解影响因素，分析可能的降解途径及产物为目的 [16]。同时也为进行其他质量研究提供依据如确定加速试验、长期试验可选温湿度等。影响因素试验一般包括高温、高湿、光照试验。

头孢克肟原料药储存条件：遮光，密封，在阴凉处保存。我们选用药物稳定性研究指导原则中高温实验条件为稳定性研究方法。即：将供试样品放置于洁净密封的容器中，在60℃条件下放置，分别在第5天和第10天取样，检测有关指标。 3.2.2 头孢克肟有关物质检测方法

中国药典2010版方法规定：取本品适量，精密称量完毕,用pH7.0磷酸盐缓冲液溶解稀释，定量，制成每1ml中含1mg的样品溶液，作为供试样品；定量精密量取，用pH7.0磷酸盐缓冲液稀释，定量制成每1ml中约含0.01mg的样品溶液，作为对照品。按照含量测定指定的色谱条件，取对照品20ul溶液注入液相色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高大约为满量程的20%，再精密量对照品溶液20ul、供试样品溶液20ul，分别注入。记录至主成分峰保留时间的2.5倍的色谱图，供试样品溶液色谱图中如果有杂质峰，则单个杂质峰面积不得大于对照品溶液主峰面积的0.5倍（0.5%) ，各杂质峰面积的总和不大于对照品溶液主峰面积的3倍（3.0% ) [16]，供试样品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.1倍的峰可忽略不计。 3.2.3 头孢克肟含量检测方法

头孢克肟含量测定方法执行中国药典2010版附录V D高效液相色谱法[16]。 色谱条件、系统适用性试验：填充剂用十八烷基硅烷键合硅胶；以四丁基氢氧化铵溶液（取10%四丁基氢氧化铵溶液25ml,加水1000ml，摇匀，用1.5mol/l磷酸溶液调节p H值至7.0) -乙腈（72:28）为流动相；检测波长为254nm；柱温为40℃。

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取适量头孢克肟对照样品，加水溶解定量稀释制成每1ml中约含lmg样品的样品溶液，在沸水浴上加热45分钟，冷却。取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按E异构体、头孢克肟的顺序出峰，E 异构体峰与头孢克肟峰的分离度应符合要求。

含量测定法：取本品适量精密称量，用流动相溶解后定量稀释，制成每1ml中大约含0.2mg的溶液，精密量取20ul溶液注入液相色谱仪，按规定时间记录色谱图；另取头孢克肟对照样品适量，按照同法测定。按外标法计算峰面积，即得含量。

3.3头孢克肟原料药小试制备

取头孢克肟甲酯20g，纯水700ml依次加入1000ml四口反应瓶，搅拌，冷阱降温至溶液内温12～15℃。加入5%的碳酸氢钠溶液调pH=6.0～6.5，观察溶液澄清。继续搅拌降温至5～8℃，加入6N氢氧化钠溶液20ml水解，HPLC监控头孢克肟甲酯残留小于1%，快速加入6N的盐酸溶液调pH=4.6～4.8中止水解反应。向反应液中加入日本白鹭活性炭，EDTA-2Na，搅拌脱色30分钟。微孔滤膜过滤，滤液转移至2000ml结晶反应瓶。

滤液室温下缓慢搅拌，加入丙酮38 ml搅拌混合均匀。匀速滴加3N的盐酸溶液结晶，控制结晶温度在23～32℃之间，使用手持式pH 计在线监控pH值，一调至pH=2.8～3.0，养晶。继续匀速滴加盐酸溶液，二调pH至2.4，冰水浴降温至0～5℃，搅拌养晶2小时。过滤，丙酮水洗涤，真空抽干。真空干燥箱保持真空度-0.09Mp，干燥温度40℃，烘干至水分合格。

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第四章 实验结果与数据分析

4.1出晶前工艺控制

结晶温度是影响产品结晶并最终成核的关键参数之一。研究分析结晶动力学可知，随着结晶温度的升高，溶质的扩散系数增大，溶质分子所具有的能量增强，从而使得晶体成核与生长速率增加，平衡的结果为较低的成核速率与较高的成长速率所得到的产品主粒度比较大[15]。而当结晶温度过高时，又会使药物不稳定，容易降解。

在头孢克肟的生产中，由于头孢类对环境的敏感性而导致后期储存过程的稳定性发生变化。本文选择添加稳定剂来控制后期的降解。稳定剂在食品添加剂的抗氧化剂中选择，抗氧化剂能去除自由基，中止连锁反应，氧化自身，拟制其他氧化反应发生，对产品的稳定性有改善作用。

养晶的pH值为出晶前后的分割点，养晶pH值未达到，则晶核数量不足，溶液的过饱和度不够，晶体生产速率过慢，导致结晶操作时间延长而产生质量及生产成本风险。养晶pH超标，则过饱和度增加，晶体迅速析出，包裹杂质、溶媒等物质，从而同样导致产品的质量问题[17]。 4.1.1结晶温度对稳定性的影响

按照3.3节中叙述的过程进行实验，其他实验条件保持不变，分别选取结晶温度23～25℃；26～28℃；29～32℃三个水平考察结晶温度对稳定性影响。三个水平因素进行平行对比实验，实验产品在60℃稳定性试验箱进行高温条件实验。三批实验产品稳定性数据如表4-1所示。

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表4-1 不同温度产品稳定性实验数据

批号

温度

检测 初检 5天 10天 初检 5天 10天 初检 5天 10天 初检 5天 10天 初检 5天 10天 初检 5天 10天 初检 5天 10天 初检 5天 10天 初检 5天 10天 水分% 11.21 11.20 11.18 11.88 11.54 11.51 11.20 10.97 10.87 11.30 11.12 10.89 10.95 11.07 10.78 10.97 10.85 10.52 11.25 11.13 11.20 11.13 11.07 11.11 11.23 11.17 11.19 检测项目 含量% 单杂% 100.94 95.75 90.85 100.26 88.27 85.47 101.18 96.34 89.96 101.84 99.82 97.98 99.84 97.33 92.00 100.84 97.87 92.24 100.58 97.66 95.23 100.72 98.36 95.92 101.27 98.46 95.97 0.08 1.03 1.48 0.10 0.98 1.88 0.33 0.56 0.97 0.14 0.35 0.56 0.14 0.60 0.84 0.15 0.71 1.06 0.09 0.57 0.76 0.10 0.53 0.75 0.09 0.52 0.74 总杂% 0.15 2.92 5.29 0.25 4.00 8.44 1.00 2.69 4.67 0.24 0.77 1.32 0.30 1.35 2.70 0.31 1.59 2.90 0.14 1.75 2.77 0.16 1.62 2.73 0.15 1.62 2.59 批号1 23～25℃

批号2 23～25℃

批号3 23～25℃

批号4 26～28℃

批号5 26～28℃

批号6 26～28℃

批号7 29～32℃

批号8 29～32℃

批号9 29～32℃

对上述数据进行综合处理，以加速10天后的结果为研究值，求出每个水平下的

2

样本均值§及样本总偏差平方和ST、试验误差平i与样本方差niSi。计算样本总均值§

方和Se。计算结果如表4-2。

表4-2 含量样本均值与样本方差表

项目 23～25℃ 26～28℃ 29～32℃

1 90.85 97.98 95.23

2 85.47 92.00 95.92

3 89.96 92.24 95.97

§i 88.76 94.07 95.71

niSi2 16.63 22.92 0.34

根据样本总均值与样本方差公式计算平方和S，均方和S，得出F值。见表4-3。

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