分子生物学题库_docx(2)

NORTHERN杂交的具体步骤 1) 待测核酸制备

2) 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 3) RNA转移到硝酸纤维素滤膜 4) 预杂交 5) 杂交 6) 洗脱

7) 放射自显影

乳糖操纵子控制模型的主要内容

1) 包括结构基因和控制基因表达的整个系统形成一个调控单位称为操纵子 2) 操纵子的活性有调控基因控制，其蛋白产物和顺式作用调控元件相互作用 3) 根据对突变的影响来区分结构基因和调控基因 4) 结构基因突变只引起其编码的特定蛋白质失活 5) 调控基因突变影响其控制的所有结构基因的表达 6) 调控基因的突变揭示了调控的类型

7) lacZYA基因的转录受lacl基因指导合成的调控蛋白控制 以乳糖操纵子为例说明操纵子基本组成元件 1) 结构基因操纵子中被调控的编码蛋白质的基因

2) 启动子能被RNA聚合酶识别，结合并启动基因转录的一段DNA序列 3) 操纵（序列）基因能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列 4) 调控基因编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因 5) 终止子给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 简述α-互补现象

许多载体都带有一个lacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补），当这种载体转入可编码β-半乳糖苷酶c端部分序列的宿主细胞时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自没有酶活性，但可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质

（蓝白斑筛选）由互补产生的lacZ能够作用于生色底物X-gal而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成lacZ（α）基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶，所以有重组质粒的菌落为白色，没有则为蓝色 阻遏蛋白结合诱导物后构型的变化 1) 阻遏物由两个二聚体组成四聚体

2) 二聚体的两个DNA结合域可以同时插入DNA大沟的两个相邻连续角

3) 诱导物结合，改变了DNA结合域和核心区之间的角度方向，使二聚体两个头部不能同时和

DNA结合，从而降低和操纵基因的亲和力 在复性反应中如何知道单链已经变成双链

1) 减色效应，测定光密度即OD值，DNA从单链变成双链OD260减少30％ 2) 羟基磷灰石柱层析：羟基磷灰石对双链吸附较牢，不易吸附单链 阻遏物同时结合两个操纵基因

1) 乳糖操纵子的操纵基因两侧，还存在两个较弱的家操纵基因

2) 完全阻遏转录，阻遏蛋白四聚体除了和操纵基因结合外，还要和其中一个假操纵基因结合 3) 同时和四聚体结合的两个操纵基因之间的DNA，弯曲形成环状结构

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诱导物改变阻遏蛋白在DNA上的分布，而不是产生游离阻遏蛋白

1) 随机DNA序列和阻遏蛋白也具有亲和力，但比操纵基因和阻遏蛋白的亲和力低107倍 2) 诱导物和阻遏蛋白结合时，阻遏蛋白和操纵基因的亲和力下降 3) 所有阻遏蛋白结合在DNA的随机序列上除去诱导物后，阻遏蛋白回复活性，从随机位点直接

转移到操纵基因 阻遏蛋白的负调控

大肠杆菌在没有乳糖的环境中，Lac操纵子处于阻遏状态，此调节基因在其自身的启动子控制下，产生阻遏蛋白，阻遏蛋白以四聚体形成与操纵基因结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子的结合，阻止了基因的转录起动，阻遏蛋白的阻遏作用不是绝对的，它与操纵基因偶尔解离，使细胞中有极低水平的β-半乳糖苷酶及透过酶的形成，当有乳糖存在时，乳糖受β-半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与阻遏蛋白结合，使之构象变化，失去与操纵子亲和力，与之解离，基因转录开放，使β-半乳糖苷酶在细胞内含量增加1000被，这就是乳糖对Lac操纵子的诱导作用 CAP的正性调节

分解代谢物基因激活蛋白CAP其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点，当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合后，作用在CAP位点，刺激RNA转录活性，使之提高50倍，当葡萄糖没有时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降 协调调节

即阻遏蛋白的负性调节与CAP蛋白的正性调节相互协调，互相制约，当阻遏蛋白与操纵序列结合封闭转录后，CAP不能启动转录，但是阻遏蛋白能脱离操纵序列而解除封闭后，如果没有CAP的作用也不能启动转录，所以乳糖操纵子的诱导作用既需要乳糖的存在，又需要葡萄糖的缺乏

乳糖操纵子的调节机制

1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。 2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。

3、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。

反义RNA调控的可能机制

1) 和靶核苷酸序列形成双链区，直接阻碍其翻译的起始

2) 在靶分子的部分区域形成双链区，易成为内切酶的底物，使其与其结合的mRNA变得不稳定 3) 反义RNA也可以与转录物结合并装扮成一个终止子，使转录提前结束 真核基因组结构特点 1) 结构庞大 2) 单顺反子

3) 大量重复序列 4) 基因不连续性

5) 非编码区多于编码区

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真核生物基因表达调控的特点（与原核生物的不同） 1) 染色体结构不同

2) 原核生物正负调控并重，真核生物主要是正调控

3) 原核生物转录和翻译相偶联，真核生物转录和翻译在时空上分开 4) 真核生物是多细胞的，具有细胞特异性或组织特异性 真核基因表达调控的特点 1) 环节更多

2) 真核基因转录与染色质

i. 染色质结构影响基因转录 ii. 组蛋白起重要作用

iii. 转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加 iv. DNA拓扑结构变化

v. DNA碱基修饰变化（甲基化） 3) 真核基因表达以正性调控为主

真核 RNA聚合酶对启动子亲和力很低，基本上不依靠自身起始转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用，真核基因调控中虽也有负性调控元件，但存在并不普遍，真核基因转录表达的调控蛋白也有其阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的以激活蛋白为主，即多数真核基因在没有调控蛋白作用时不转录，需要表达时要有激活的蛋白质促进转录 真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面差异

1) 在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，原核生物中最常见的多基因操

纵子形式在真核细胞中比较少见

2) 真核细胞的DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合，只有一小部分DNA是裸露的 3) 高等真核细胞DNA中很大部分不转录，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子 4) 真核生物能够有序的根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内

某些基因的拷贝数，这种能力在原核生物中也是极为鲜见的

5) 在缘何生物中，转录的调节区都很小，大都位于转录起始点上游不远处，调控蛋白结合到调

控位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶对它的结合，在真核生物中，基因转录的调节区则大得多，它们可能远离核心启动子几百个甚至上千个碱基对，虽然这些调节区也能与蛋白质结合，但是并不直接影响启动子区对于RNA聚合酶的接受程度，而是通过改变整个所控制基因5’上游区与DNA构型来影响它与DNA聚合酶的结合能力

6) 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜到达基质后，才能被翻译成蛋白质，

原核生物中不存在这样严格的空间间隔

7) 许多真核生物基因只有经过复杂的成熟和剪接过程才能被顺利的翻译成蛋白质 增强子特性

1) 增强效应与其位置和取向无关 2) 大多为重复序列，一般长约50bp

3) 其增强效应应有严密的组织和细胞特异性 4) 增强效应十分明显

5) 没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应 6) 许多增强子还受外部信号的调控 P53基因与细胞癌变

1) 正常情况下，细胞分裂与p53基因无关

2) 如果细胞中的DNA受损，p53基因被激活，使细胞受阻于G1阶段，直到DNA被修复或启动

细胞凋亡程序

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3) 如果细胞中p53基因的两个拷贝同时被破坏，细胞可能直接死于有丝分裂过程中，也可能带

着损伤继续分裂，从而导致恶性肿瘤 原核生物的基因调控

原核生物的基因调控主要是转录调控，包括负转录调控和正转录调控，在负转录调控中，调节基因的产物是阻遏蛋白，组织结构基因转录，根据其作用特征又分为负控诱导和负控阻遏两大类 在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录

在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录，阻遏蛋白作用于操纵区 在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白，根据其作用特征分为正控诱导系统和正控阻遏系统

在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态，在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态 建立植物转化受体系统的主要考虑因素 1) 高效稳定的再生能力 2) 较高的遗传稳定性

3) 具有稳定的外植体来源 4) 对选择性抗生素过敏

5) 对农杆菌侵染具有敏感性 再生系统的选择

1) 选择年幼的外植体，易于脱分化 2) 选择增殖能力强的外植体 3) 选择萌动期的外植体

4) 选择具有强再生能力基因型的外植体 5) 遗传稳定性好 遗传转化方法

1) 以载体为媒介的遗传转化，也称间接转移系统法，如农杆菌介导法 2) 外源目的DNA的直接导入，如基因枪法，花粉管通道法 根瘤农杆菌介导法

Ti质粒作为载体的可能性：

1) 能够自发的整合到植物的染色体上 2) 能转化多种植物 3) 强启动子

天然Ti质粒载体的缺点 1) 分子量太大

2) 限制性酶切位点太多

3) 被转化的植物细胞称为肿瘤，不能再分化 4) 在大肠杆菌中不能复制 发根农杆菌介导法

Ri质粒通过T-DNA转移到被侵染植物中，使其生成毛状根，农杆碱型Ri质粒上的T-DNA呈不连续分布，与TL-DNA，TR-DNA及TL-DNA上的基因与毛状根的形成有关同时也影响着再生植株地上部分形态和一些生理性状，TR-DNA的基因tms1和tms2能指导LAA的合成，因此转化生成毛状根，在培养时不需要添加生长激素 Ri质粒转化的优点：

1) Ri质粒可诱导植物外植体生成毛状根并由其再生成植株 2) 毛状根属于单克隆，可避免形成嵌合体

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3) Ri质粒与Ti质粒可共同构建双元载体，拓展其二者的应用范围 4) 毛状根在离体培养条件下具有合成原植株次生代谢产物的能力 5) Ri质粒可以作为植物转化的有效载体，且可生成次生代谢产物 RNA在生物体内主要作用

1) 在遗传信息的翻译中起重要作用 2) 具有催化功能和其他持家功能

3) RNA转录后的加工和修饰要依赖于各种小RNA和其蛋白质复合物 4) 对基因表达和细胞功能有重要调节作用 5) 在生物进化中起重要作用 RI质粒介导转化的基本程序

受体材料含植物转化载体的农杆菌菌液 (原生质体，细胞，组织或器官等)

侵染

共培养

诱导不定芽 （常加入选择压力）

筛选培养

生根培养

外源基因整合检测 (PCR,Southern检测)

外源基因表达检测

田间试验，遗传分析，性状鉴定

转基因植株

经典实验题

如何利用重组实验来证明RNA是遗传物质 如何证明DNA是遗传物质

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