单机试验 -- Zimm Plots 数据处理
主要内容:
? 采用多角度激光光散射仪单机模式（batch mode）测定样品分子量； ? 硝酸钠溶液体系测定右旋糖苷（400kDa）的 Mw， Rz，A2
任务目标:
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熟悉多角度激光光散射仪与ASTRA 软件以及Template调用、自定义Template； 掌握单机模式下数据的采集操作；
掌握dn/dc作用；学会baseline、peaks区域选择操作； 了解右旋糖苷（10 kDa）作用；
掌握LS analysis中模型适用范围（Zimm、Debye、Berry、Random coil）； 掌握enable detectors与enable peaks 处理操作
单机试验下能测定哪些量?
? 平均重均分子量（weight average molar mass）、z均方半径（z-average rms radius）第二维利系数（A2） 。
单机试验可使用的条件
? 无法使用SEC ，例如需要使用不同类型的SEC柱或不同溶剂条件 ；
? SEC柱可能改变样品性质，例如SEC柱可能对高分子量样品具有剪切效应；或柱填料与样品具有较强相互作用；
? 测定平衡常数（equilibrium constant）或反应动力学常数（kinetics） ? 监测反应过程
如何进行单机试验测定？
? 激光池子类型选择： 流通池（flow cell），光散射瓶（scintillation vial）（仅适合HELEOS），微量比色皿（microCuvette）。
? 已知量：dn/dc，样品浓度（concentration）（注：可使用RI 或 UV测定样品浓度）
试验方案（池子类型：流通池）
? 要求：每一浓度对应的LS信号稳定（平台）
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? 不同进样方式：
o HPLC 泵 + dndc进样系统（定量环体积：1000 μL）； o 注射泵（Syringe pump）+ 注射器（syringes）；
o 梯度合成进样系统：自动配制样品浓度梯度，并自动进样。 ? 要点: 避免气泡与灰尘进入流通池。
试验细节:
? 要求: 获取 Zimm plot 时，样品浓度梯度至少需要5个；
? 使用注射泵或HPLC 泵+ DNDC 进样系统；流速测定： ~ 0.5 mL/min； ? 采集纯溶剂初始/最末基线值；
? 归一化标样（Normalization standard）：右旋糖苷30kDa（5 mg/mL）； ? 5个样品浓度（浓度 0.2 ~ 2.0 mg/mL ）； ?
过滤头:
o 使用0.02 μm 过滤头（syringe tip filter）过滤溶剂； o 使用0.2 μm 过滤归一化标样；
o 可使用0.45 μm 过滤高分子量样品； ? 注射器（Syringes）
o 水相溶剂 – 带橡胶头注射器适合所有高分子溶液。
o 有机溶剂 – 禁止使用带橡胶头注射器；避免样品污染。
讨论话题：
? 请确认已通过进样系统将溶剂或样品注入DAWN 或 miniDAWN仪器流通池中。? 查看或通过forward laser monitor 判断流通池中是否存在气泡。 ? 评价流通池清洁程度。
? 使用各向同性散射体归一化（低分子量，一般小于50kDa）； ? 使用ASTRA 采集数据；
? 处理光散射数据获取 Zimm Plot； ? 评价 Zimm Plot；
? 选择angle fit degree 和concentration fit degree。 ? 选择需删除的 concentrations与 detectors
? 尝试使用不同拟合模型（fit models），例如Debye、Zimm 、Berry。
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ASTRA V 数据采集Template调用
Open ASTRA V (current version) ，Create a new experiment from a system template: File New Experiment from Template System Templates Light Scattering Batch (Zimm plot)
软件默认仪器为 HELEOS。若为其它型号仪器，如miniDAWN TREOS 或 EOS, miniDAWN Tristar等，则按照以下步骤继续操作：
右击 Configuration Replace Configuration Example Configurations Light Scattering TREOS LS Batch
单击所有 “+” ，展开所有参数列表，依次按照以下步骤继续操作：
HELEOS:
在 Physical Instrument 点击 “…”
（提示：可能需要点击Add添加仪器）
Sample Cell: K5 （与Certificate of Performance报告一致)
Calibration Constant: 请输入使用甲苯校正值
(或使用 Certificate of Performance报告中的值)
OK Solvent:
System Solvents: Water
OK
Sample:
Dn/dc: 0.138mL/g
OK
+ Procedures
Basic Collection Duration: 30 minutes Collection Interval: 2 sec
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Apply
Run
数据采集开始；
采集已过滤溶剂信号 ~ 5 min；
采集3-5 min 10 kDa 右旋糖苷（dextran）信号； 采集每一浓度的未知样品（Dextran）信号； 再次采集已过滤溶剂信号 ~ 5 min；
采集时间（duration）确定后，可输入时间延长延长。或使用Run Indefinitely 选项延长采集时间，待数据采集完毕，必须点击Stop 才能停止采集。
Basic collection 窗口采集的数据。
unknown dextran
10 kDa dextran
Baseline
提示: 单机试验，使用注射器注入样品时，必须带上过滤头。
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ASTRA 试验数据处理
Procedures Baselines 为 90° detector 定baseline 点击 Autobaseline 为其它角度自动定基线。
查看其它角度基线情况。
OK Define Peaks
点击10 kDa Dextran 对应信号起点，按住鼠标左键，并拖动至结束点，从而选择归一化峰区域。
OK
Configuration （菜单栏experiment - configuration） Normalize Peak number: 1 Radius (rms): 6 nm 点击 Normalize OK
重新返回 Peaks 删除 peak 1 (该峰仅用于归一化，不参与 Zimm plot) 为C1-C5浓度对应信号定 peaks： Ctrl+ 左键，并拖动以放大； 按住左键，并拖动选择平台区域 右键，选择autoscale 输入每一信号对应的浓度： C1 = 2.00 E-4 g/mL C2 = 5.00 E-4 C3 = 1.00 E-3 C4 = 1.50 E-3 C5 = 2.00 E-3 OK
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