时间分辨荧光分析技术

1.1 时间分辨荧光分析技术

时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。

本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。

1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质

稀土元素指的是元素周期表中IIIB族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s和5p电子对4f电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。

3530ENERGY,103cm-12520597nm5D415D35D4483nm4F9/2G5/2615nm5D0545nm1510566H13/2H9/277F2F070Sm3+6H5/2F57F66H15/2Eu3+Tb3+Dy3+

图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图

Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions

大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为

例，其荧光发光机理如图1.2所示[9]，包括三线态发光机理和单线态发光机理。当铕(III)配合物受光激发后，配体分子吸收激发光能量由基态S0跃迁至第一单线激发态S1，处于此激发态的分子不稳定，可以通过辐射跃迁的方式返回基态，发出配体荧光（S1→S0），也可以通过系间窜跃（非辐射跃迁方式）将能量传递至配体的第一三线激发态T1。处于T1能级的配体分子可以通过辐射跃迁的方式回到基态，发出配体磷光（T1→S0）；当T1能级高于Eu3+的共振能级时，能量就可以进一步传递给Eu3+使之激发至共振能级，并在由共振能级跃迁回基态的过程中发出Eu3+的特征荧光，此即三线态发光机理。而上述处于S1激发态的配体分子如果不经过T1激发态，直接将能量传递给Eu3+使之激发至共振能级，然后由共振能级跃迁回基态发出Eu3+的特征荧光，此即单线态发光机理。到目前为止，绝大多数的Eu3+配合物的荧光发光都遵循三线态发光机理，只有极个别的遵循单线态发光机理。

S1 S1iscenergytransferpromptligandfluorescenceiscT15D321promptligandfluorescenceT15D5D5energytransferabsorptionabsorptionphosphorescence5D5D01phosphorescencethermaldecayD07F7F7620F6F2F07S0ligandEu3+S07F7

ligandEu3+

(a) (b)

图1.2 铕(III)配合物发光机理示意图：（a）三线态发光机理；（b）单线态发光机理 Fig. 1.2 Schematic diagrams of the radiative processes of the chelate leading to Eu3+ fluorescence by (a) triplet excited state mechanism and (b) singlet excited state mechanism

不同于有机荧光化合物，稀土配合物的荧光性质，一方面取决于有机配位体的三重态能级T1的位置，另一方面取决于配位体与稀土离子处于激发态时的能量匹配程度。荧光发光的波长和强度，均随稀土离子的不同而不同。Sm3+、Eu3+、Tb3+、Dy3+等稀土离子的配合物属于镧系元素荧光配合物中的强荧光物质。激发这些离子所需能量较低，同时由于这些离子的激发态和基态能量相差较大，非放射迁移较小，因此它们的荧光量子产率相对较高。

由于稀土荧光配合物特殊的发光机理，使其相对于常规有机荧光化合物，像荧光素和罗丹明等而言具有以下特点：

（1） 荧光发射的特征峰波长主要与中心离子有关，而与配位体结构关联不大。稀土配合物发光是基于配合物内由配位体到中心金属离子的能量转移所产生的，配位体吸收激发光能量后转移到中心稀土离子，然后再通过中心稀土离子的4f轨道能量跃迁而发出荧光，即接受激发光能量和发射荧光是由不同的部分所完成的，因此同一种稀土离子与不同配位体形成的配合物的荧光发射峰波长基本不变。

（2） 荧光寿命非常长，通常在10 μs（Sm3+、Dy3+）或100 μs（Eu3+、Tb3+）以上。这是由于稀土配合物的发光是经过配位体的三重态的能量转移所致，所产生的荧光是延迟荧光，其寿命比配位体的磷光寿命还要长。从表1.1可以看出，Eu3+配合物的荧光寿命比普通荧光化合物的荧光寿命要长大约105倍。利用这种长荧光寿命，就可进行百微秒级的时间分辨荧光测定。

（3） 稀土配合物所发荧光的Stokes位移 (最大发射峰与最大吸收峰之间的波长差) 非常大，大部分在200 nm以上，对克服因激发光而导致的散乱光对测定的干扰很有利。

（4）荧光激发谱带较宽，有利于增高激发能，而发射峰非常尖锐，半峰宽通常在10~15 nm，为类线性光谱，有利于降低本底，提高分辨率。

稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质比较[10-12]见表1.1。

表1.1 稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质

Tab. 1.1 Fluorescence properties of lanthanide complex and conventional organic

compounds

Compound FITC RBITC Cy5 Eu(?--NTA)3

Lifetime (ns) 4.5 3 ---- 7 x 105

λex,max (nm) 492 550 650 340

λem,max (nm) 518 585 667 613

Stokes shift

(nm) 26 35 17 273

Quantum yields (Q)

0.85 0.70 0.27 0.209

ε (mol-1Lcm-1) 7.0 x 104 1.2 x 104 2.5 x 105 3.6 x 104

FITC: Fluorescein isothiocyanate; RBITC: Rhodamine-B200-isothiocyanate; Cy5: Cyanine dye;

?--NTA: 2-naphthoyltrifluorobutanedione.

1.1.2 时间分辨荧光测定原理

时间分辨荧光测定技术是利用稀土配合物具有长寿命荧光这一特点，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命的不同引入一定的延迟时间 (delay time)，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信号进行测定，原理如图1.3所示。采用时间分辨荧光测定技

术可以有效消除来自样品、试剂、仪器等的短寿命非特异性荧光的干扰，从而极大地提高荧光检测的灵敏度。

Flash excitationCycle time (1000 ?s)Fluorescence intencityShort-lived background fluorescenceLong-lived lanthanide fluorescenceDelaytimeCounting timeRecovery time02006001000Time (μs)图1.3 时间分辨荧光测定的原理

Fig. 1.3 Principle of time-resolved fluorescence measurement

1.1.3 时间分辨荧光免疫分析技术

时间分辨荧光免疫分析技术是采用具有超长荧光寿命的稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光生化分析技术。详细内容将在1.2.4.5节进行叙述。 1.1.4 时间分辨荧光显微镜生物成像技术

荧光显微镜生物成像技术因其具有可视化特点，已成为不同生物环境中生物分子的可视化及生物功能的阐述等方面的一种强有力的工具[13,14]。然而对于一些复杂生物体系来讲，体系本身的自发荧光及仪器背景荧光会对荧光成像产生严重干扰。在过去十年中逐渐发展起来的时间分辨荧光显微镜生物成像技术是基于长寿命稀土荧光标记物而建立起来的，目前被广泛应用于免疫组织化学[15-17]、免疫细胞化学[18]、原位核酸杂交[15,16]、生物分子可视化和定量测定[19,20]、细胞中特定离子检测[21]及环境微生物检测[22,23]等方面。该技术的最大优点是能够在脉冲激发和荧光成像检测之间引入适当的延迟时间，从而消除常规荧光显微镜测定时生物样品的短寿命本底荧光对测定的干扰，使得影像具有更高的灵敏度和信噪比。

1992年，Soini等以4-(4’-异硫氰基苯乙炔基)-2,6-二(胺甲基-N,N-二乙酸基)-吡啶-Eu3+配合物标记的抗体或SA为探针，用于与人结肠恶性粘膜癌相关的C242抗原、人软骨性生长II类胶原质mRNA、人宫颈扁平上皮细胞中的HPV特异基因的时间分辨荧光显微镜成像定位[15]。实验结果表明通过时间分辨荧光成像方法

可以有效消除免疫组织化学及核酸原位杂交反应中的样品自发荧光对测定的干扰，从而实现在细胞和组织水平上的高对比度成像测定。使用Eu3+荧光标记物的时间分辨荧光显微镜测定技术还被用于人类血清中胰岛细胞自身抗体的定量测定 [20]。该方法首先在载片表面将血清和胰腺组织反应，然后载片再与铕配合物标记的抗人IgG抗体反应，最后进行时间分辨荧光显微镜测定。该法的信噪比要比常规测定法大12倍。1999年，Lilja等人将铕荧光配合物标记的SA用于前列腺组织中前列腺特异抗原的免疫组织化学测定[17]。比起使用过氧化物酶标记SA的测定法，时间分辨荧光显微镜成像测定法具有高信噪比和高灵敏度的优点，可用于替代所有使用过氧化物酶标记SA的测定法。2001年，L?vgren等人以铕纳米微粒作为荧光标记物，采用时间分辨荧光成像方法实现了对单个前列腺特异抗原分子的可视化检测[19]。2004年，Piper等人报道了利用时间分辨荧光显微镜成像技术检测浓缩水样中的病源微生物Cryptosporidium和Giardia。他们首先将BHHST-Eu3+配合物分别标记上抗Cryptosporidium单抗和羊抗鼠二次抗体，然后分别与浓缩水样中的Cryptosporidium和经单抗预处理过的Giardia共同孵育，最后进行时间分辨荧光成像检测。结果显示水样中杂质的强背景荧光被完全消除，检测信噪比增强了10倍[22]。2007年，Nagano等开发出一种基于铕配合物的Zn2+选择性化学传感器，将其注射进入活Hela细胞内，利用时间分辨荧光显微镜能够监测出细胞内Zn2+浓度的变化[21]。

铽配合物用于时间分辨荧光显微镜成像测定也有报道[24]。Saavedra等合成出一种可直接标记细胞的铽荧光配合物，其配位体是由三种化合物组成的结合体，其中一部分用来与Tb3+形成荧光配合物，一部分用于与细胞膜的结合，该配合物被用于全反射时间分辨荧光显微镜成像以用于培养细胞的形态学研究[25]。

随着具有更优异的荧光性能如高量子产率、可见光激发和良好细胞通透性等的长寿命稀土荧光标记物被开发出来，以及时间分辨荧光显微镜系统的改进，相信时间分辨荧光显微镜成像技术必将会在更为广泛的研究领域中得到应用。

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