国自然 面上项目标书范例(2)

国家自然科学基金申请书 2010版

疗靶点，取得非常好的疗效。本研究对于确定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做为分子治疗靶点、设计合理的治疗药物可以提供更有利的素材。 参考文献：

[1] He J, Gu D, Wu X, et al. Major causes of death among men and women in China. N Engl J Med

2005;353:1124–34.

[2] 吴孟超，廖美琳，陆嘉德 常见恶性肿瘤治疗进展 上海 科技教育出版社2007

[3] Bryant DM, Stow JL. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends Cell Biol. 2004

Aug;14(8):427-34

[4] Wells A, Yates C, Shepard CR. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting

transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 2008;25(6):621-8. Epub 2008 Jul 4

[5] Salon C, Lantuejoul S, Eymin B, et al. The E-cadherin-beta-catenin complex and its implication in lung

cancer progression and prognosis. Future Oncol. 2005 Oct;1(5):649-60

[6] Howard EW, Camm KD, Wong YC, et al. E-cadherin upregulation as a therapeutic goal in cancer

treatment. Mini Rev Med Chem. 2008 May;8(5):496-518.

[7] Guo C, Liu QG, Yang W, et al. Relation among p130Cas, E-cadherin and beta-catenin expression,

clinicopathologic significance and prognosis in human hepatocellular carcinoma. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2008 Oct;7(5):490-6.

[8] Zhai B, Yan HX, Liu SQ, et al. Reduced expression of E-cadherin/catenin complex in hepatocellular

carcinomas. World J Gastroenterol. 2008 Oct 7;14(37):5665-73.

[9] Fransvea E, Angelotti U, Antonaci S, et al. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates

E-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 2008 May;47(5):1557-66.

[10] Osada T, Sakamoto M, Ino Y, et al. E-cadherin is involved in the intrahepatic metastasis of

hepatocellular carcinoma. Hepatology. 1996 Dec;24(6):1460-7

[11] Auerkari EI. Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a), p27(Kip1) and E-cadherin in

carcinogenesis. Oral Oncol. 2006 Jan;42(1):5-13.

[12] Wei Y, Van Nhieu JT, Prigent S, et al. Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma:

Correlations with genetic alterations, β-catenin expression, and clinical features Hepatology 2002 Sep;36(3):692-701

[13] Yu J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may

contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002, 2:29

[14] Fujita Y, Krause G, Scheffner M,Hakai, et al. Hakai, a c-Cbl-like protein, ubiquitinates and induces

endocytosis of the E-cadherin complex. Nat Cell Biol. 2002 Mar;4(3):222-31.

[15] McLachlan R W, Yap A S. Not so simple: the complexity of phosphotyrosine signaling at cadherin

adhesive contacts. J Mol Med 2007 85:545-554.

[16] Avraham H, Park SY, Schinkmann K, et al. RAFTK/Pyk2-mediated cellular signalling. Cell Signal.

2000 Mar;12(3):123-33.

[17] Behmoaram E, Bijian K, Jie S, et al. Focal adhesion kinase-related proline-rich tyrosine kinase 2 and

focal adhesion kinase are co-overexpressed in early-stage and invasive ErbB-2-positive breast cancer and cooperate for breast cancer cell tumorigenesis and invasiveness. Am J Pathol. 2008 Nov;173(5):1540-50.

[18] Iiizumi M, Bandyopadhyay S, Pai SK, et al. RhoC promotes metastasis via activation of the Pyk2

第 6 页

国家自然科学基金申请书 2010版

pathway in prostate cancer. Cancer Res. 2008 Sep 15;68(18):7613-20.

[19] Sun CK, Man K, Ng KT, et al. Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) promotes proliferation and

invasiveness of hepatocellular carcinoma cells through c-Src/ERK activation. Carcinogenesis. 2008 Nov;29(11):2096-105.

[20] Sun CK, Ng KT, Sun BS, et al. The significance of proline-rich tyrosine kinase2 (Pyk2) on

hepatocellular carcinoma progression and recurrence. Br J Cancer. 2007 Jul 2;97(1):50-7.

[21] Zhang X, Xu LH, Yu Q. Cell aggregation induces phosphorylation of PECAM-1 and Pyk2 and

promotes tumor cell anchorage-independent growth. Mol Cancer. 2010 Jan 14;9:7

[22] Zhang S, Guo D, Jiang L, et al. SOCS3 inhibiting migration of A549 cells correlates with PYK2

signaling in vitro. BMC Cancer. 2008;8:150.

[23] Vitale G, Gentilini D, Abbruzzese A, et al. Pyk2 and Cyr61 at the cross-road of cAMP-dependent

signalling in invasiveness and neuroendocrine differentiation of prostate cancer. Cancer Biol Ther. 2009;8

[24] Turowski P, Martinelli R, Crawford R, et al. Phosphorylation of vascular endothelial cadherin controls

lymphocyte emigration. J Cell Sci. 2008 Jan 1;121(Pt 1):29-37.

[25] Potter MD, Barbero S, Cheresh DA. Tyrosine phosphorylation of VE-cadherin prevents binding of

p120- and beta-catenin and maintains the cellular mesenchymal state. J Biol Chem. 2005 Sep 9;280(36):31906-12.

[26] Jian Chen, Lu Y, Meng S, et al. alpha- and gamma-Protocadherins Negatively Regulate PYK2. J Biol

Chem. 2009 Jan 30;284(5):2880-90

第 7 页

国家自然科学基金申请书 2010版

（二）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。 １.主要研究内容

1）确定E-cadherin与Pyk2体外、体内相互作用、作用位点以及调节关系。 A．取E-cadherin与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。

B.选取二者表达量都适中的肝癌组织，行内源性免疫共沉淀，证明在体内二者也相互作用。

C.应用免疫荧光技术和蔗糖密度梯度超速离心方法分析细胞组分的方法确定E-cadherin与Pyk2在细胞中共定位。

D.应用磷酸化实验，确定E-cadherin是否是Pyk2的底物，应用定点突变的方法，确定酪氨酸的磷酸化位点。（同时再次确证E-cadherin能否影响Pyk2激酶活性。）

2）从细胞水平确定Pyk2对E-cadherin的调节影响细胞迁移。

A.筛选Pyk2稳定表达细胞株，然后应用Transwell细胞迁移实验观察过表达Pyk2的细胞其迁移性、侵袭性的变化，检测过表达Pyk2时E-cadherin的磷酸化状态和蛋白水平的变化，确定Pyk2对E-cadherin磷酸化状态的调节影响细胞迁移。

B.取高转移肝癌细胞株MHCC97-H 、HCCLM3 (购自上海中山医院肝癌研究所)，应用RNAi技术沉默Pyk2的表达，观察细胞迁移性、侵袭性的变化，检测相应状态下E-cadherin的磷酸化状态和表达水平的变化。从相反方向确定Pyk2的表达抑制后对E-cadherin磷酸化状态的调节，以及这种调节对细胞迁移的影响。

3）从动物模型水平确定Pyk2对E-cadherin的调节影响肿瘤转移。

应用Pyk2稳定表达细胞株接种裸鼠，观察裸鼠肿瘤肺转移肝转移情况，分析Pyk2的过表达对E-cadherin磷酸化状态的调节关系，以及与肿瘤转移的相关性。

4）从肝癌病人标本中寻找Pyk2与E-cadherin磷酸化状态的相关性，以及与肿瘤转移的的相关性。

收集肝癌标本，应用免疫组化和Western等方法确定Pyk2的表达水平的变化与E-cadherin磷酸化状态和蛋白水平的相关性，以及二者与肿瘤转移的相关性。

２.研究目标

1）确定Pyk2结合E-cadherin相互作用的结构域及磷酸化位点，并阐明其调节机制。 2）确定Pyk2与E-cadherin的调节可影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。

３.拟解决的关键科学问题

E-cadherin酪氨酸残基的磷酸化导致其被降解，增加细胞侵袭性。本课题能够确定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2与E-cadherin的调节是否是调节肿

第 8 页

国家自然科学基金申请书 2010版

瘤细胞转移的新的分子机制。

（三）拟采取的研究方案及可行性分析。 １.研究方法

GST-pull down，荧光共定位，内源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速离心，磷酸化实验，定点突变，稳定表达细胞株的筛选，RNAi抑制Pyk2表达，细胞迁移、侵袭实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验，免疫组化，定量PCR，Western检测等。

２.关键技术说明：

1）磷酸化实验

首先应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为阳性参照，以纯化的GST-E-cadherin蛋白为底物，以GST蛋白作为阴性对照，观察Pyk2 是否可以磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin则应用生物信息分析，定点突变，寻找磷酸化位点；如果不能磷酸化E-cadherin，则以通用底物E4Y1作为底物，加入不同量的E-cadherin观察是否可以影响Pyk2的激酶活性。 2）细胞迁移实验

首先分别用空载体PCDNA3.1， PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc转染肝癌细胞株（PRNK为Pyk2的C段，为Pyk2的失活突变体），用G418筛选出稳定表达细胞株。并检测稳定表达细胞株Pyk2蛋白表达量的不同。

然后应用稳定表达细胞株做Transwell细胞迁移和侵袭实验，比较细胞迁移率的变化；检测细胞迁移率的变化与Pyk2蛋白表达量的关系。同时取相应细胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化以及这些变化与肿瘤迁移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。 3）裸鼠成瘤肿瘤转移实验

取上述三组稳定表达细胞株分别接种裸鼠，待肿瘤直径约1-1.5cm时取出肿瘤重新接种于另外一批裸鼠的肝左叶。接种5星期左右处死裸鼠，收集肝脏和肺脏，观察肝内转移情况和肺转移情况。检测三组肿瘤Pyk2蛋白表达量的不同以及与肿瘤转移的关系。同时取相应肿瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化，确定这些变化与肿瘤转移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。

4）蔗糖密度梯度超速离心定位和内源免疫共沉淀

取肝癌肿瘤的癌旁组织，裂解离心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速离心。取离心后的不同组分样品做Western，分别用E-cadherin抗体和Pyk2抗体作为一抗检测。如果二者表达最多的峰值是在同一个组分中，则提示我们二者在细胞内是共定位的。 取上述二者的表达较多的组分，用Pyk2单抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作对照），

第 9 页

国家自然科学基金申请书 2010版

然后用E-cadherin单抗杂交检测E-cadherin是否能与Pyk2共沉淀下来。相反方向则是：用E-cadherin单抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作对照），然后用Pyk2单抗杂交检测Pyk2是否能与E-cadherin共沉淀下来。

３.技术路线（见下图）

磷酸化实验确定E-cadherin是裸鼠成瘤转移实验:Pyk2蛋白表达量、E-cadherin磷酸化水平与肿瘤转移的关系。 荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证在细胞以及肿瘤组织中共定位 细胞迁移实验:测Pyk2蛋白过表达和RNAi抑制时与E-cadherin磷酸化水平、细胞迁移的关系。 免疫组化、Western等方法检测E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2表达量的相关性，以及与肝癌转移的相关性。 否是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点 定点突变，GST-pull down，免疫共沉淀等方法验证确定相互作用的结构域以及位点 筛选稳定表达Pyk2肝癌细胞株，检测Pyk2蛋白表达量与E-cadherin磷酸化水平的关系。 收集肝癌病人标本和临床资料

汇总分析数据：揭示Pyk2磷酸化E-cadherin机制；揭示Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。 1. 左侧部分：取E-cadherin与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证二者在细胞以及肿瘤组织中共定位；磷酸化实验确定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点。这部分内容从生化的角度确定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子机制。

2. 中间部分：通过细胞迁移实验、裸鼠成瘤转移实验从细胞水平、动物模型确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。

3. 右侧部分：收集肝癌病人标本和临床资料，通过免疫组化、Western等方法检测E-cadherin /Pyk2蛋白水平、磷酸化状态，分析二者表达量的相关性，以及与肝癌转移的相关性。

4. 最下面部分为汇总数据，总结分析。

4.可行性分析

1） 前期实验已经从酵母双杂交、GST-Pull Down、免疫共沉淀等证实了

第 10 页

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库国自然 面上项目标书范例(2)在线全文阅读。