硫氧还蛋白与癌症(2)

很多重要的细胞功能以应对氧化应激,包括DNA修复,细胞生长与增殖和细胞凋亡。 已经证实,Trx基因的表达受氧化应激诱导,这种诱导现象主要由Trx启动子中Nrf2与ARE元素相连结来调节。TrxR和Prx启动子也包含ARE元素，它是负责在应对氧化应激时的诱导表达。值得注意的是,在处于还原态的Trx可以增强Nrf2与ARE的连结,从而激活它。此外,Ref-1在应对氧化应激反应时表达上调。因此氧化应激会导致Trx水平的升高,进而激活转录因子诱导更高水平的Trx和其他抗氧化剂。

众所周知的是,癌症细胞与正常细胞相比处于氧化应激升高状态。增加的氧化损伤的DNA基质已经发现存在于许多癌组织中。此外,已经发现在体外人类肿瘤细胞系比非转化细胞系产生相对大量的活性氧,从而使这些细胞保持持久的氧化应激状态。这些在癌组织细胞中高含量的ROS通常与含有极高浓度的Trx和其他氧化还原控制蛋白质结合在一起,这将在稍后讨论(参见硫氧还蛋白和癌症)。 六、硫氧还蛋白和缺氧

一个细胞内的氧气水平低于正常水平的氧张力时会发生缺氧。尽管缺氧通常会打破细胞氧化还原体内平衡对细胞产生危害,但它确实有一些有益的作用。例如,在胚胎形成时会发生缺氧现象,缺氧信号被认为是胚胎正常发育所必需的条件。

在对低氧反应中, HIF-1（低氧诱导因子）蛋白质是稳态的并会诱导一些基因的表达,这些基因功能改善通过血管生成和红细胞生成来提高氧合作用。HIF-1的可用性是主要取决于HIF-1α亚基,通常是由于其快速、氧依赖性的降解而处于抑制状态,而HIF-1β亚基不受氧气水平的调控。在缺氧时,HIF-1α蛋白质处于稳定状态,转移到细胞核,与HIF-1β形成二聚物绑定到目标DNA序列的启动子或不同的基因的增强子区域(图1b)。

HIF-1的蛋白质也受除了缺氧其他许多因素调控,包括致癌基因,生长因子,很矛盾的自由基如超氧阴离子、过氧化氢和一氧化氮。例如,裸露的一氧化氮基团已被证明在含氧量正常情况下HIF-1α中特定的半胱氨酸残基亚基转化成硝基甲苯磺酸酐,从而抑制其降解。此外,在人类293细胞过氧化氢的调节机制会诱导HIF-1α提高稳定性和HRE（缺氧反应因素）-荧光素酶在含氧量正常条件下的表达。因此,ROS能使HIF-1α在含氧量正常条件下更加稳定(图4)。

图4 硫氧还蛋白(Trx)和ROS在缺氧性应激中的反应。在正常含氧量条件下HIF-1α在胞质中降解而在缺氧条件下HIF-1α变得稳定并转移到细胞核中。在低氧条件下，胞质过氧化氢的存在对HIF-1α的稳定是必要的。在细胞核中,还原条件对HIF-1与DNA绑定是很必要的。在细胞核中，Trx促使Ref-1减少而减少了HIF-1α亚基,然后与HIF-1β共聚陈二聚体形成HIF-1。HIF-1蛋白质与HRE元素绑定而诱导靶基因转录。红线显示一个抑制效应。红十字表示非功能性的线粒体。

图4

越来越多的证据表明,线粒体中形成ROS也与HIF-1α在低氧环境的稳定性相关联,尽管增加的ROS似乎比发生在氧化应激反应程度小得多。一项研究表明,细胞中含有非功能性线粒体不能在低氧反应中增加HIF-1α含量。另一项研究使用RNAi（核糖核酸干扰）来抑制复杂III线粒体中Rieske铁硫蛋白的表达，表明ROS形成和HIF-1α表达水平在低氧环境下将会减少。然而,添加过氧化氢到细胞导致了增加了HIF-1α蛋白在缺氧。同样,在人类293细胞中过氧化氢在缺氧条件下被抑制,通过过氧化氢酶过表达、使HRE（缺氧反应元素）-荧光素酶的表达受到抑制(图4)。这些观测结果表明,过氧化氢在细胞中的存在对于HIF-1α在低氧条件下的稳定是必要的。

相比之下,几项研究表明, HIF-1与DNA在细胞核的绑定需要减少条件。例

如,HIF-1与过氧化氢或二酰胺的纯化处理降低了HIF-1与DNA结合活性。然而,在之前添加二硫苏糖醇(DTT)会避免这个效应(图4)。这些结果表明,HIF-1本身对氧化还原很敏感。实际上,正如前面所提到的,抗氧化蛋白Trx和 Ref-1已被证明在缺氧条件下能通过调制HIF-1α亚基的单个半胱氨酸残基来提高HIF-1的转录活性的(图4)。此外,一个突变的Ref-1中的目标半胱氨酸残基在遇到羟基自由基时能阻止HIF-1α活性降低。这些结果表明,Trx在缺氧性应激反应中扮演重要的角色。

此外,证据表明,Trx在缺氧条件下影响HIF-1的表达已被几项细胞中Trx过表达的研究中证明。这些细胞显示增加了HIF-1α水平、增强了HIF-1与DNA绑定连结和增加了HIF-1靶基因的活性,如血管内皮生长因子(VEGF)和环氧合酶-2

（COX-2)。相反,研究使用惰性的氧化还原Trx可以清晰地显示出HIF-1α蛋白水平的减少。此外,Trx和TrxR抑制剂已被证明下调HIF-1α的表达及其后续活性,这进一步强调了Trx在调控HIF-1α表达中的作用。

这些结果也与其它研究结果表明Trx和相关的氧化还原蛋白质在低氧条件下表达上调相一致。例如,当HT-29细胞处于低氧条件下，Trx和TrxR mRNA的表达分别各自增加了14倍和4倍。在肺癌细胞Trx和Prx在缺氧条件下他们的mRNA和蛋白质含量都被上调。肿瘤微组织与宫颈癌活检标本中也发现Trx和Ref-1的表达在低氧条件下上调。然而,低氧条件下Trx的诱导机制尚不完全清楚。Trx没有证据表明这种效应是受HIF-1调节。

总之,这些结果表明缺氧和氧化还原控制调控过程存在重要纽带并表明在缺氧条件下ROS和Trx在调控HIF-1表达方面至少与经典缺氧条件下的诱导通路调节有同样重要的作用。 七、硫氧还蛋白和癌症

人们普遍认为,氧化应激和缺氧应激都是肿瘤的特征。这些情况可以部分解释为肿瘤增长过速,而其血管网络也快速增长,因此缺乏氧气和营养物质。含氧水平的降低影响着HIF-1的稳定性和活性,进而诱导如血管生成这样的过程发生。尽管血管生成发生在几乎所有人类的实体肿瘤,它的效率不高,从而导致氧气运输在空间和时间上的不足。因此,一些肿瘤组织区域可能会慢性缺氧,而其他的肿瘤区域可能会循环缺氧,由于不规则氧气流通导致其在缺氧和再氧合的状态中切换。再氧化阶段紧跟缺氧应激出现无意中导致了氧化应激。

因为癌症细胞通常处在高氧化应激或缺氧应激状态下,他们还高水平表达包括Trx,Prx和Ref-1的抗氧化蛋白也就不奇怪了。例如,Trx的表达在几个原发性的癌症中会升高,包括肺癌、子宫颈癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌、胃癌和乳腺癌。Trx和相关蛋白质的上调表达已假设为肿瘤恶性增殖与良性细胞增殖的动态的氧化还原变化的标志。

一些研究表明,Trx的过表达促进了癌症细胞的生长,无论是通过直接刺激癌细胞生长或通过抑制肿瘤细胞凋亡。在这些研究中,MCF-7乳腺癌细胞被氧化还原惰性的Trx构造转染。Trx的蛋白质以一种不活跃的方式在在各个构造中产生。转染的MCF-7细胞接种到免疫缺陷的小鼠体内后，几乎完全抑制肿瘤的形成，癌细胞的逆转表型转换也是明显的。另一项研究表明,MCF-7细胞在以剂量依赖的方式用三氧化二砷(ATO)处理时生长会受到抑制。MCF-7细胞的抑制生长与失活的TrxR有关,导致Trx氧化和整个Trx系统的失活。此外,最近的一个体内研究进一步凸显Trx在促进癌细胞生长的重要性。两个人类肺癌细胞株,表达高或低的Trx水平,肿瘤生长的程度与皮下注射的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠被感染的组织细胞中Trx的水平相关。这些细胞中Trx低水平表达催生小肿瘤,而细胞中Trx高水平表达会催生出更大的肿瘤。总的来说,这些研究表明,Trx在促进癌细胞生长中有一个活跃的作用,其表达也不仅仅对癌症进展有重要影响。

在体外和体内Trx高水平的表达都与高度攻击性和转移性肿瘤的活性有密切

关系。一个体外研究使用神经细胞瘤细胞株出现的可能机制证实Trx提高了癌细胞转移活性。这些细胞中Trx被证明可以促进细胞入侵,通过抑制MMP的抑制剂来促提高基质金属蛋白酶(MMP)活性。一个体内研究使用两个人类Trx表达水平的高低不同的癌细胞株注射小鼠，进一步证明Trx促进癌细胞的转移。感染了Trx高表达的小鼠的肺中癌细胞明显出现转移，而感染Trx低表达的小鼠肺中癌细胞则没有出现明显的癌细胞转移。此外,另一项研究在前列腺癌上操作两个不同氧化还原表型的细胞系表明还原态更强的细胞株系的细胞入侵性更强。同样,被检测出Trx高水平表达的肿瘤患者大多被诊断为乳腺癌、黑素瘤、甲状腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌。

此外,Trx高水平表达和其他抗氧化蛋白使细胞对多种化学药剂产生耐药性,包括阿霉素、强的松、紫杉醇和它莫西芬。例如,在一项研究中,肿瘤组织取自乳腺癌患者显示p53、BRCA-1、Bcl-2 的表达与烯紫杉醇没有显著相关性。然而,肿瘤中Trx低水平表达的细胞比Trx高水平表达的细胞对紫杉醇的反应敏感的多。在另一项研究中,44个乳腺肿瘤样本用多烯紫杉醇处理后进行基因表达分析,共有2453个基因分析序列。在多烯紫杉醇耐药细胞中,将近一半的样本,提升了氧化还原蛋白基因的表达,尤其是还原谷胱甘肽、S-转移酶、过氧化酶和Trx。

Trx过表达也会导致患者对强的松产生抗性,通过清除细胞内抗癌剂产生的有毒氧化剂。此外,卵巢癌细胞株,胃和结肠癌细胞,都伴随细胞内Trx表达水平的升高。这些研究结果表明Trx在癌细胞中通过抑制细胞凋亡,刺激细胞转移、提高入侵活性和参与抗化学药物等活动，说明Trx在癌细胞的生长和增殖中都扮演者相当活跃的角色。另一个重要的观察是,许多肿瘤的攻击性与他们的氧化还原表型有关,而他的表型是由Trx的表达所决定的。考虑到Trx在癌细胞中发挥的许多作用,因此,毫不奇怪,Trx和其他Trx系统的成员已经被提出作为研究抑制肿瘤生长,增殖和转移的化合物的关键靶标。

虽然Trx本身一直被视为一个潜在靶标,TrxR一直是大部分Trx系统抑制剂的焦点。一个TrxR抑制剂导致Trx的氧化,从而改变整个Trx系统的功能。一些TrxR抑制剂已在临床试验中作为癌症治疗试剂测试过其中一些已被FDA批准使用。三氧化二砷(ATO)是一种被FDA批准的已成功地用于治疗急性早幼粒细胞性白血病的化合物。ATO与不可逆转的TrxR结合,这与抑制MCF-7 乳腺癌细胞的增长有相关性。含金化合物在一段时间也被作为癌症治疗药物研究的优先选项,包括金诺芬,把TrxR作为他们的靶标。Xcytrin是一种像卟啉的分子，目前在临床试验中治疗各种类型的癌症,也能够抑制TrxR。所有这些高效的TrxR抑制剂有一个共同的特征,就是他们主要作为助氧化剂并且由于其高毒性能导致严重的副作用。未来的一个替代方法可能出现在天然产品中,包括抗氧化剂丰富的食物和饮料,他们可以在人体高浓度存留。姜黄素就是这样一个例子,一个常用的调味品,展现出不错的抗癌效果和不可逆转地抑制TrxR的功能。最近,绿茶和红茶被发现含有抗氧化剂的成分,这些成分可以抑制TrxR并能抑制希拉细胞在体外生长。

然而,需要更多的信息来支持这些成分对不同类型的癌细胞发挥作用。癌细

胞的氧化还原表型的不同可能是一个主要的决定因素,这些成分可以选择性的选定目标癌细胞。尽管氧化还原表型的癌细胞的特点由Trx的表达程度决定,进而影响肿瘤细胞的氧化还原水平,缺氧和氧化应激之间的循环可能也是一个主要的癌细胞增殖及其对不同癌症治疗试剂灵敏度不同的因素。 八、硫氧还蛋白和缺氧循环

一个组织中含氧量状态是氧气传递和消耗之间平衡的结果。因为在肿瘤组织中血管生成异常所以这种平衡经常被打破。相反,肿瘤通常有很少的小动脉供给,低效的微血管取向、低血管密度、极端变化的微脉管红细胞通量和血液粘度的增加。所有这些因素导致肿瘤组织中高度不稳定的氧供应。因此,肿瘤组织最重要的特点是,其氧气供应是周期性的,这种现象通常被称为缺氧循环或间歇性缺氧。

缺氧循环在近30年前被发现,此后出现了强有力的证据证明缺氧循环动力学是复杂的,至少有两个重要的时间表,它们互相叠加在一起。一个频率每小时几个周期而第二个时间尺度从几个小时到几天不等。最近的研究表明,红血细胞通量的波动的频率更快,而血管重建的频率较慢。

大多数关于缺氧循环的研究都集中在血管生成和HIF-1的调控。其中的一些研究也显示了HIF-1活性上调取代了慢性缺氧。因为缺氧循环所涉及到的一些再氧化阶段,很容易推测,ROS和抗氧化剂水平的提高也会出现。然而,只有有限的研究关于的抗氧化剂与肿瘤氧化作用的动态变化有关。 8.1 缺血预处理

大多数关于抗氧化剂和缺氧循环可用的数据来自心脏疾病缺血/再灌注的研究。心暴露在再灌注引起的短时间内的缺血循环对致命缺血性损伤产生抗性。这种技术通常用于心肌保护，被称为脑缺血预处理(PC)。缺血预处理的心脏保护能力已经被证明是被氧化还原反应调控的。例如,缺血预处理治疗小鼠心脏被Trx抑制剂CDDP(一种抗癌剂)处理时会产生一个废除的生存信号，大量的心肌细胞在预处理心肌后凋亡。此外,心脏缺血预处理治疗后氧化应激显著降低,而CDDP抑制Trx会使心脏丙二醛的数量不断增加从而使氧化应激增强(图5)。有趣的是,缺血性心肌衰弱与Trx的超表达有关。

虽然有几项研究暗示了Trx在缺血预处理的生存信号传导中的角色,其作用机理仍需要被阐明。有趣的是,最近的研究表明,小鼠心脏缺血预处理时Trx和Ref-1迅速转移到细胞核。注入发卡结构的RNA的反义Trx会一直Trx向细胞核转移，反转录Ref-1抑制Ref-1向细胞核内转移。此外,缺血预处理中Trx和Ref-1在核内出现结合。这项研究还揭示了NF-κβ的DNA链和磷酸化的Akt(一种蛋白激酶)都会增加,这增加了细胞存活几率，而当Trx或Ref-1受到抑制时这些现象就会全部消失。此外,治疗心脏缺血预处理还说明了Nrf-2和Ref-1在细胞核中的紧密联系,当反转录处理Ref-1时会减少这种联系。同样,也观察到Trx和Nrf-2在细胞核内紧密联系,也减少了反转录Ref-1的存在(图5)。

总之,这些结果表明,在小鼠的心脏细胞缺血/再灌注循环存活信号是氧化还

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