石蜡切片的制作程序

石蜡切片的制作程序

1、病料的采集：

采集病料要及时，以防组织变质发生自溶。病理组织材料要采取病变典型突出的部分，最好选病变与健康组织的交界处，以识别和探讨病变的发生和发展。组织块一般不宜过大，以3～5mm×3～5mm×10～15mm为宜。过大过厚的组织块容易影响固定和浸蜡的质量，不易切出较好的切片。采取病料时应保持器官组织的原来形状，用锋利的刀剪切取，切勿挤压，损伤或扭折，以免造成人为的损伤。 2、固定：

固定的目的是使组织和细胞的较粗大的结构尽量保持正常状态，避免发生形态学结构变化，使细胞保持一定的硬度，以利于切片。采取的病料组织块应及时投入固定液内进行固定，以防腐败。并做好标记，便于识别。固定液用量一般为组织块体积的10～20倍。

固定剂的种类很多，一般能凝固或沉淀蛋白质及脂肪等成分的药品都可以做固定剂。如：酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、升汞等等。可以按照不同的目的来选择使用固定剂，常用的固定剂主要是福尔马林(formalin 37～40%的甲醛)，最适合固定的浓度为10%福尔马林(3.7%～4%甲醛)，固定和保存时所用的溶液是指福尔马林的百分比，而不是甲醛，例10%福尔马林溶液是10毫升的福尔马林加上90毫升的水配成。所以10%的福尔马林，实际上仅含3.7～4%的甲醛。

福尔马林易被氧化为甲酸，故常带酸性，为得到中性福尔马林可加吡啶、碳酸钙或碳酸镁的方法使之中和。例如在100毫升的25%福尔林中加5毫升的吡啶；可使它的pH上升到7.0；10%的福尔马林可被过量的碳酸钙中和为pH6.4；如果用碳酸镁则为pH7.6。冲淡的福尔马林(10%)更易氧化，为了保持它的中性，可于其中放入几小块大理石。

福尔马林必须为无色透明，若贮藏时间较长或存放在温度太低会变混浊，呈絮状物。为防止该现象的发生可提前加少许甘油以阻滞其聚合，沉淀物则可加热溶解，如加热仍不能溶解，则可加等量热的0.8%碳酸钠或0.4%氢氧化钠(约60～70℃)溶液，在室温放置2～3天，沉淀物就会消失。此时福尔马林淡了一倍，稀释时要相对地减少一半,含有杂质的福尔马林，通常加热至98.7℃蒸馏，可得30%的纯净福尔马林,稀释再用。

福尔马林作为单纯固定液，以贝克氏(Bakers’)改良为好。其配方如下： 蒸馏水 90毫升 福尔马林(37～40%)甲醛 10毫升

无水氯化钙 1 克 加氯化钙可改变固定液的渗透效应，更好地保存细胞原形。 3、冲洗：

材料自固定液中取出后，须立即冲洗，使其中含有的固定液全部除去，一直到洗净为止。常用的冲洗方法如福尔马林固定的组织可用自来水缓缓冲洗，冲洗时间视固定时间和组织块大小不同而异。一般挂于水笼头上冲洗6～24小时。 4、脱水：

脱水的目的在于使组织中的水分完全除去，并使组织变硬。各种材料经固定与冲洗后，组织中就含有大量水分，而材料又逐渐变软，不能直接投入石腊中包埋，因为水和石蜡是不相溶合的，一定要经过脱水剂将水分脱净，透明剂透明后，才能进行包埋。

一般常用脱水剂为酒精、丙酮、二氧六环等。

脱水的方法是在室温下将脱水剂用水配成不同的梯度浓度，然后将组织块置入其逐级进行脱水。如50%、70%、80%、90%、95%(各2小时)，100%（Ⅰ）100%（Ⅱ）各1.5小时。

脱水时应注意每级中停留的时间依材料的大小、性质以及固定液的性质而定。但不十分严格，柔软组织每级可停1～2小时，坚韧组织可停1～4小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。 5、透明：

组织块脱去水分之后，需经透明才能浸蜡。因为酒精等脱水剂与石蜡不能溶合，必须经过一种既能与酒精等脱水溶合又能与石蜡溶合的溶剂的处理，才能使石蜡易于浸入组织。

常用的这种溶剂有二甲苯、甲苯、苯、氯仿等。

一般过程是100%酒精“+”二甲苯（1：1）20分钟、二甲苯（Ⅰ）15分钟、二甲苯（Ⅱ）15分钟。

如果组织块有局部不能透明有呈白色混浊状态时，则是因脱水不彻底所致，应退回重新脱水，然后再透明。 6、浸蜡：

组织块经透明之后，即可浸入已溶化之石蜡中使石蜡渗入组织内部，这一过程即称为浸蜡，浸蜡的全过程应在恒温设备中进行，应注意控制温度。温度过低则石蜡凝

固成固相，不利于渗入组织；温度过高则组织受损变脆，不利于切片。

一般常用以54～56℃溶点的石蜡为宜。如能在石蜡中掺入一些纯蜂蜡，更有利于切片。将恒温箱（或锅）调至58℃。

一般是二甲苯“＋”石蜡（1∶1）的混合液进行预处理约30分钟(亦在溶蜡的温度中进行)，然后浸入纯石蜡（Ⅰ）２～３小时、纯石蜡（纯石蜡Ⅱ）２～３小时。

浸蜡必须彻底，否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片的质量。控制时间和温度，既要彻底浸蜡，又要时间短。 7、包埋：

将浸蜡完毕的组织块凝封在小蜡块中，这一过程你为包埋。在一定容器内(小纸盒、包埋框、小玻璃皿等)注入溶化之石蜡，将已浸的组织块置入其内(应使欲切之组织面向下)，使蜡块迅速冷却硬固，组织块在蜡块中可长期保存。 8、石蜡块的整修：

整修蜡块的目的在于使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲，以便于镜检或作连续切片，为了达到这一目的，整修时，须将石蜡块上下两面修成平等的面，这样切成的蜡带就成直线。整修时应将上下左右多余的石蜡修掉，但也必须注意不要太靠近组织，把组织裸露在外又会造成切片时易破碎的不良后果，所以组织四周的蜡层不应少于2毫米。此外，为了便于在蜡带上分开每一切片，可将石蜡块的一角切去。 9、切片与展片

旋转式切片机的切片方法：

先进行用具的准备：滑行切片机，切片刀，毛笔二枝，培养皿一套。然后将带有蜡块的木块固定在切片机的标志夹内。将切片刀安装妥当,与组织块成15°夹角，调节切片机上的微动装置，使厚度计达到所需切的厚度，一般为6～8um，调节好刀口与组织块的距离便可开始切片。转动旋转轮柄，摇动一转可切下一片，弃去前几刀的切片，待切片均匀平展时，用毛笔将切片粘下，置于温水（42～45℃）中展片，切片完毕后，切片刀和切片机必须注意清理和擦洗干净。 10. 贴片及烤片：

待石蜡切片自然伸展平之后，用预先均匀涂一层贴片液(1∶1蛋白甘油液)的载玻片轻轻地从水中捞取切片，拨正位置，控干水分，然后放入温箱内烘干(37～45℃)约需２～４小时，或在温室中自然干燥(约需一夜)，亦可将切片置于玻片上，再加少量水，然后持玻片在灯上加温切片伸展。

11、染色：

染色的目的在于使组织或细胞的不同成分之间有明显的对比色，以利于显微镜下观察。石蜡切片常用苏木精，伊红对比色法(简称H·E染色)进行染色。

苏木精本身不是染料，需经氧化以后形成氧化苏木精才有染色作用。苏木精染料一种配方如下：

哈里斯(Harris’s)苏木精： 配方：甲液

苏木精 0.5克 95%酒精 5毫升 乙液：

甲矾或铵矾(硫酸铝铵) 10克 蒸镏水 100毫升 氧化汞 0.25克 冰酸酸 几滴 配法：

(1)将0.5克苏木精溶解于5毫升95%酒精中。

(2)溶解10克钾矾或铵矾于100毫升的蒸镏水并加热煮沸。 (3)将上述两液混合煮沸半分钟，并加入0.25克氧化汞。 (4)很快地在冷水浴锅中冷却。

(5)冷却液过夜后用双层滤纸过滤，并加入冰醋酸几滴，以加强核的染色。此液配制后可保存一、二个月。

伊红为染胸浆，胶原纤维，肌纤维及嗜酸性颗粒等常用染料，是一种酸性染料，伊红的种类很多，名称也不统一。有伊红Y，乙基伊红(醇溶伊红)、伊红W(水溶性)等。使用浓度一般用0.5～1%，染色时间30秒至数分钟。 H·E染色操作方法序列如下：

·脱蜡：将欲染的切片(贴附于载玻片上)浸入二甲苯(Ⅰ)以溶去石蜡(１５分钟)，再入二甲苯(Ⅱ)洗涤(１５分钟)、二甲苯“＋”100%酒精（１：１）２分钟

·用无水酒精(Ⅰ)２分钟、无水酒精(Ⅱ)２分钟以除去二甲苯。

·依次在95%、85%、70%、50%各级酒精中浸泡各２分钟，再入蒸馏水２分钟，使切片不致从高浓度酒精中骤然进水而脱落。

·切片以Harris氏苏木液染10分钟。

·用自来水泡洗２分钟，以洗去多余的染液及浮色。

·用盐酸酒精分化（约１分钟，需摸索条件），使切片呈砖红色，然后水洗（约１分钟），以脱去细胞质染上的苏木色素。

·１％氨水兰化（约１分钟）或自来水15min，使组织返回兰色，镜下检查可见细胞核染成兰色，胞浆无色，用蒸馏水泡洗约１分钟。

·将玻片置于50%、70%、85%、95%酒精逐级脱水（约２分钟）。

·浸入95%醇溶伊红染色５分钟，再经两次无水酒精各2分钟，以彻底脱水。 ·经二甲苯(Ⅰ) 、二甲苯(Ⅱ)透明，各8分钟，以除尽组织中的酒精成分，并使切片呈透明状，以利观察。

·树胶封固：切片在二甲苯(Ⅱ)中取片，不等二甲苯干燥即滴上一滴中性加拿大树胶，用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧，并把它的左边放在树胶的左边，然后左手持一解剖针扶住盖玻片的左边，右手将镊子松开逐渐下降，慢慢抽出，这样树胶在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出。甲二甲苯擦干净出盖片周边多余溢出的树胶，将切片置于平稳，干燥之处，稍加重压，待树胶干燥凝固，切片即可长期保存观察。 观察时应注意的事项：

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