基因克隆(包括DNA提取技术步骤)

基因克隆

DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。

一 DNA的提取

二目的DNA片段的获得 （酶切） 三体外重组

1 LB培养基的配制

2大肠杆菌感受态细胞的制备 3载体的选择

四 导入受体细胞 五 重组子的筛选 1插入失活法

实验一 DNA提取

取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：

1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。（常温操作） 2 恒温箱裂解，55℃。30min。

3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇 25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。（注意酚在油层下面）

4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇 24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。

5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。在-30度冰箱沉淀30min。离心4度12000g 10分钟。 6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。 7 重复一次上述操作。

7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。 8 溶解于200ulddwater。 9 定量DNA。

裂解液的配制

1ml体系 200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。作用抑制酶的活性。）

螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。

50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）

10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液 5ul PK（消化） 735ul 灭菌超纯水

EDTA（0.5 M，pH8.0）

将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒），定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。EDTA二钠盐加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0时，才会溶解。

实验二 目的DNA片段的获得（酶切）

获得了包含目的基因在内的DNA，这些DNA或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA。由于基因组DNA较大，不利于克隆，必须将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法是核酸限制性内切酶消化。 仪器：

台式离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪 试剂

EcoRⅠ,Hind Ⅲ酶,DNA样品（浓度>0.3μg/μl）1X TAE缓冲液。 操作

(一)EcoR Ⅰ单酶切。

1, 取1支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入（ul） 灭菌水 13 EcoR Ⅰ缓冲液 2 DNA 4 3ug EcoR Ⅰ １ 10U 20ul体系。

２，37℃保温１－4小时，也可过夜。

3，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)。 4，取10μl左右的反应液加入1μl电泳加样缓冲液，电泳。目的片段回收。 注意：１，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。 ２，加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。 ３，反应体系的体积要尽量少，要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10。 4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，因此如底物DNA浓度过低则应进行真空浓缩。

实验三 LB培养基的配制

LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源、能源和磷酸盐，蛋白胨主要提供氮源，NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化。琼脂在40℃时凝固（高压灭菌融化琼脂糖），通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温不同而有所不同。

LB培养基用来培养细菌，将其pH调至中性或微碱性，利于细菌生长繁殖。 器材和试剂

酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂，氨苄青霉素(Amp)；1mol/L NaOH； 锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，细菌培养皿，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸，记号笔，纱布，封口胶。 1000ml体系LB液体培养基：参考《分子克隆实验指南》 在950 ml去离子水中加入:

胰化蛋白胨(bacto-typtone) 10g ， 酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g ， NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.

用1mol/LNaOH（大约1ml）调pH至7.4. (适合E.coli的生长) 用去离子水定容至1L.

在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（全过程需要2小时）锡箔。常温保存。 氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成50mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。 LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉。 1．称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g. 放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。

2 在烧杯中加入950 ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解.用1mol/LNaOH（800ul）调pH至7.4，再用去离子水定容至1L。转移到试剂瓶中再加入加15g琼脂粉。高压灭菌。

2.抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）在超净台加入1/500体积50mg/ml抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。（类似琼脂糖制胶）

3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

1kg=1000g 1g=1000mg 1mg=1000ug 1ug=1000ng

试验四

大肠杆菌感受态细胞的制备（超净台）

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化（Transformation）是指质粒DNA或以它为载体的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性液体培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含氨苄青霉素的选择性固体培养基上。 【仪器、材料与试剂】 (一)仪器

1．超净UV工作台 2．低温4℃离心机 3．恒温摇床37℃180rpm/min 4．-80℃冰箱 5．恒温水浴器 (二)材料

1．氯化钙(CaCl2) 2.LB培养基（液体） 3大肠杆菌DH5a（kit） 4．50mL离心管 5．吸嘴、小指管 6．试管、培养皿、锥形瓶等 (三)试剂

1．0.05 mol/L CaCl2溶液（分子量110.98） 灭菌后4℃保存。

2. 氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成50mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。 3. LB液体培养基。

大肠杆菌感受态细胞的制备

1. 从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于含有5 mL LB液体培养基的试管中，37℃。180rpm/min振荡培养过夜。

2. 取5 mL菌液转接到一个含有100 mL LB液体培养基1000ml锥形瓶中，37℃ 180rpm/min振荡培养90min。

3．将菌液转移到冰预冷的50 mL离心管中，冰上放置10 min。 4．4℃，离心10 min(4 000 r/min)，回收细胞。 5. 倒出培养液，将管倒置1 min以便培养液流尽。

6. 用冰冷的0.05 mol/L CaCl2 20mL悬浮沉淀，立即放在冰上保温10 min。 7. 4℃ 4 000 r/min，离心10 min，回收细胞。

8．用冰冷的2 mL 0.05mol/L CaCl2悬浮细胞(务必放冰上)。加入甘油至终浓度为15%；

9. 使用1.5ml离心管分装细胞，每200 ul一份。此细胞为感受态细胞。-80℃保存备用。

本实验使用生物公司感受态大肠杆菌DH5a。

本实验使用克隆载体质粒是PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR

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