荧光定量问题汇集(2)

1. 内参基因和目的基因有差距，并不影响realtime 实验结果，

2.样本中内参和目的基因本身的表达相差大，导致实验时起飞点不一致，另外，内参没有到达平台期，也没有影响，之所以出现这种情况，可能是引物浓度偏高，再加上样本中内参基因本身表达偏高 3.两者图片，一直是扩增曲线原始图，一张是软件分析后的图。

2. 1.一般ABI的仪器起跳循环数好像是15-35个比较可靠一些,但超出这个范围多少意义不大我也不清楚,

我想是和仪器有关系

2.一般光滑S形扩增曲线就是比较好的了,我看你的挺好 3.阈值国内试剂一般要求CT大于6,不是尽可能小

4.我CDNA量比较少，增加PCR的模版量很困难，不知可否把引物、探针及Buffer的量等比减少，来相对增加模版量呢？- 我觉得就是改变体系,那的从新摸条件,可以试试,但我觉得你现在的挺好,不知你跑电泳看了吗?建议不要更改

我觉得是这样,不知大家和你的意见咋样

3. 1.你说gapdh起跳晚,我看不晚,这是基因表达量决定的,不知你哪条是标准品

以及标准品的拷贝数是多少,可以分析一下,表达量是多少,但一般就是你这个 范围起跳,表达量大概就是10^6-10^7左右,起跳的早晚不是你能调整的(当然 标准品是可以调整的)

2.你要他们之间差距不那么大也是不现实的,一般都要有差距的,因为GAPDH的 表达丰度多高于目的基因,这很正常

3.GAPDH起跳早，但40个循环达不到平台期及目的基因起跳晚，但很快就到达平台期,只要你加样等操作没问题,这并不影响数据的统计,不用调整 我是这样认为的,不知大家有何高见

半对数图

Keykey:那是开始的时候荧光强度波动造成的,正常现象.都会有的.开始的时候SYBR 也会结合一些双链的,所以会发光.但不稳定.也就是初始阶段的波动,所以基线(baseline),不会从1开始,一般从5左右,那时候荧光强度稳定.

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楼主的第一种溶解曲线有少量特异产物，所以说是少量，因为特异产物的溶解曲线峰值相对杂带的峰值不是很高。

第二种溶解曲线明显有杂峰，但尚不能断定哪个是，因为根据个人的经验，引物二聚体多容易在75度左右出现溶解曲线，而楼主的溶解曲线最低温度也在80度。

第三个没有特异性产物，只是一些smear,因为没有特异的溶解峰出现。如果可以排除试剂问题，考虑出现以上现象的原因有两种：

1. cDNA完整性差，可以从改善RNA提取及RT过程来解决，

2. 引物的特异性差，建议更换引物，个人体会如果引物的特异性差，无论如何优化条件都不会得出太令人满意的结果，遇到这种情况，我一般都是更换引物。

楼主不妨用用同实验室别人用着好用的引物扩增一下自己的 cDNA，基本就可以判断出自己RT产物的好坏了。

同样，楼主也可以用一下别人扩增非常成功的cDNA来当模版，用自己的引物扩增一下，就可以知道自己的引物如何。

另外还有一点，就是对楼主的PCR程序设计有些不解，为何在一个循环中要进行3 次读板，这样出来的扩增曲线会不会在三个温度间互相干扰，因为在单通道的情况下，每一个样品只能出来一条扩增曲线，这样3次读板形成的荧光值之间必定会互相影响，尤其是第一次的读板温度是68度，正好低于引物二聚体的解链温度，这样引物二聚体所产生的荧光就会影响真正的产物的荧光。

从楼主所作的溶解曲线来看，如果产物的解链温度是85.3度，建议读板温度设在82-83度之间比较好，因为这时片段比较小的杂带基本都降解了，杂带所形成的荧光强度最小。而目的条带几乎没有降解。

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楼主，你把所有的16个sample都设置成了标准品（即standard），那系统就会默认将这16个结果都纳入标准曲线的计算中。

建议你在分析时，只取4-6个宽范围的sample，在面板设置中设成standard，其他都设成unknown，然后再按那个分析的键。这样标准曲线就应该出来了。

标准曲线要做复管吗？一般是2管还是3管？另外，文章发表前编辑审稿时需要看什么？谢谢！keykey: 当然要做重复，一般三个就可以了。论文发表时，只需要处理后的结果，我们一般用柱状图加上error bar即可。不需要raw data的。

溶解曲线出现三个峰，以为是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。产物经电泳证实却为一条带，为什么会出现这种结果？key key: 我也曾经出现过这个问题，但是我是出现两个峰，后来跑电泳证实是引物二聚体，〈100bp的地方隐约出现一个引物二聚体的条带，你跑电泳没有其他条带可能是电泳的灵敏度不够吧，还有引物产生二聚体也不一定只产生一种结构的二聚体啊，可能会产生其他结构的二聚体啊，建议你可以继续设计引物再试试，或者提高退火温度看看！你的单一条带是不是很宽啊？照图上看来你的非特异性的产物和你的目的产物差不多大。非特异性扩增的条带的Tm值和你的产物的还是有点

接近。而且不一定是跑胶都能看到非特异性扩增的。我以前做完后跑胶都没有目的条带，但是扩增曲线还是不错，但是荧光值都比较低。实时定量还是很敏感的。 建议提高温度，如果没有目的条带，就试着调一下镁离子浓度。

最近作REAl－time PCR有几个问题请教： 1. 产物可以进行电泳检测吗？

2. 为什么阴性产物进行二次扩增也有较强的荧光信号（据CT值可判为阳性）？且电泳似乎也有较量的条带，无法与阳性产物区别。

3.在CT值无法判断阴性或阳性的情况下（接近或略高于判定阴性值时，有扩增曲线，但CT值较大如37，38）如何下结论？KEYKEY：1. 荧光定量的结果可以进行电泳检测。

2。如果阴性有扩增，说明PCR体系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很难消除。

3。结论根据原来定的标准下，比如原来设定ct>35为阴性，那当ct为36时就不要特意调整标准。确定其为阴性就可以了。

4。阳性产物做模板ct较低，其原因是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。所以，模板浓度越高，ct越低。

1、 产物是可以用来电泳的，不过由于定量PCR借助于荧光的作用灵敏度较高，电泳产物则一般条带不会

很亮；

2、产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，原因很简单，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高灵敏度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，还有很多是一时想不到的；

3、如果你是用标准的检测试剂盒，你只需要按说明书来就操作就可以，判断结果同样，如果你还想探究其中的阴性可能漏检的问题，你应该用其他方法，而不能用这个试剂盒了。

通过前辈的介绍了解到：正常的ct值范围在18-30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数 如果正常情况下大于30应可以定为阴性。因为最近我也在用SYBR Green做实时定量PCR, 所以也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。我的结果中待测基因的Ct值大多在18-25之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在12-14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到18-30之间呢。KEY KEY: 没必要吧

一般ct超过30是不好,但要是三个重复都这样,也还是可以用的啊,每次都做阴性对照

阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染,而是基因表达量低或是模板太稀,内参ct为10－14都正常啊,没必要再稀释模板了,那样你的目的基因ct又要超过30了,不过内参ct太低,低于10也是不太好,结果可能会有偏差.

real-time pcr结果可用来发文章的要求有哪些？KEYKEY：不用，但是在文章必须说明用电泳还是用溶解曲线检测过。论文中把 你的实验方法说明白就可以了。简单的一个表示图，就可以发表了。不过REAL-TIME PCR 想用的话最好放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。

不知道为什么这两天做荧光老不顺，荧光ＣＴ在２０以下产物检测很亮，而普通用mix酶跑ＰＣＲ条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的原因吗？

另外我的ＮＴＣ荧光时在３０多个循环的时候都有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了．求大家帮帮忙吧．KEYKEY：1 一些公司荧光定量试剂盒的酶是比普通Tag酶要好，主要是可以防止引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。

2 也可能是你荧光定量的体系比你普通的PCR体系要优化，比如有些公司荧光定量mix中的Mg离子浓度

要高于普通的PCR体系。

3 可能是跑胶的问题。看看你的MARKER还和以前一样亮吗？

做荧光定量的短片段特别容易污染。可能是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？如果在35个循环后起峰，污染不算严重。可以把荧光定量PCR的基线调节到恰好高过阴性对照。

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=7883753&sty=1&tpg=21&age=0 看你用的是MJ的opticon系列了。不清楚你的条件，但是从扩增曲线上看 1、荧光强度都是0.001-0.01的，这有点太小了。扩增效率很低

2、你的baseline是如何扣除的？扣除方法可能影响你的曲线。建议你扣除5-15循环的avarage 3、melting curve虽然看起来是很好的结果，但是还建议你电泳下看看。

请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照嘛？ 这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？

还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以嘛？ 不知道要怎么稀释比较好呢？

KEY KEY: 阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。 临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。

本人检测的目的基因共有5个处理，每个处理做两次重复，现在的问题每个处理内重复性非常差，有的Ct值差异达到了10，不知道是怎么回事？

KEYKEY：换了一个退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，现在有一对引物两个温度都还好。基本上能够达到要求了。

另外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差异挺大的，因为之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上了一个，结果差异很大。经验教训啊！

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=7789235&sty=1&tpg=23&age=0荧光量开始很高 keykey根据TAKARA的资料说,这是因为摸板浓度过大了,把它在稀释,然后再做看看. 是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的CT值很小。但是这张图也能用的，你调整一下基线范围，把背景荧光压下去，这样以来图就漂亮了就能分析了。

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=7754719&sty=1&tpg=24&age=0

刚做了一次real time PCR,结果解离曲线中出现了负值keykey?!?: 这个曲线反应的是随着温度的变化,荧光值的变化速率.值越高,则此时PCR产物荧光值变化越快,也就是说PCR产物变性速度最快.

当温度达到Tm值时,PCR产物迅速变性,荧光值急剧下降,表现在这张图上就是出现一个峰.产物越纯,峰越窄,PCR产物越多,峰越高.这样看来,出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快.70-80度时,已经出现变性,但是较为缓慢.但是你的产物看来不是特别纯,峰比较宽,可能要改变反映条件或者改变引物.

请教大家，我用sybgreen，扩增目的片断60bp realtime pcr,ct 值17~22之间，溶解曲线看每个样本都是单峰，blank无扩增，电泳检测也是单条带。看起来还可以，只是总发现单峰的宽度（peak width）在3.3~4.0之间，而以前做其他的基因扩增单峰都是很窄的，大约1.2左右。请问大家，峰较宽说明什么？和片断的长度有无关系？这样的结果可否接受，如果不可怎么改进？??????

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