第11章 体外试验与新生物技术在毒理学中的应用

第八章 毒理学评价的分子生物学方法

分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子，但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜上、细胞器内，乃至细胞间隙液中的。它们与细胞是不可分离的。因此，对亚细胞组分的研究也是毒理学分子生物学评价的重要组成部分。

第一节 亚细胞组分的制备

现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。现就细胞膜、微粒体及线粒体的制备方法加以介绍。 一、细胞膜的制备

细胞膜指细胞外层质膜，厚度约6～10nm。它将细胞与外环境分隔，且参与细胞的生命活动，细胞内各种细胞器也是由质膜分隔，称为细胞器膜，两者统称为生物膜。它是常用的研究模型，用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒机制。 1．肝细胞膜的制备

其基本原理是：首先，将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆，使细胞膜保持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中分离，再利用细胞膜与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核部分中分离出来。

2．红细胞膜的制备

哺乳动物红细胞不含任何细胞器，故其红细胞膜是较纯净的细胞膜。 (1)红细胞血影膜

常用的制备方法是在低渗条件下，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物因胞膜破裂而释放，20 000g离心。洗涤去除血红蛋白，即获红细胞膜。此种膜最接近整体系统，仍保留着原有膜的生物化学和生物物理学等特性，毒理学试验常用简易模型研究外源化合物对细胞膜离子转运及相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响，并探讨其可能的机制。但它不能控制细胞质内的环境，在应用上有一定的局限性。此外，低渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞内质，但膜的封闭性差，有许多泄漏的空穴。 (2)再封血影

近年发现，在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对K’等离子不通透，给研究红细胞膜提供了另一模式。其制备的方法有：

①向低渗胀破的红细胞加入浓盐溶液，成为等渗溶液，置于37℃温育20min，期间可缓慢地搅拌，即得一定比例的再封血影。

②将低渗胀破的红细胞在0℃条件下，过Bio—gel A柱，柱上部的1／3pH为7．6，以利膜与血红蛋白分离，其下的2／3pH为6．0，有利于随后红细胞空泡的重新封闭，当膜从柱上流出后再用一定浓度的Kcl调节为等渗液，在37℃温育1h，即获得重新封闭的血影。 (3)封闭的红细胞膜囊泡

有时为了深入研究，需要将膜的内、外层翻过来。红细胞溶血后，在不含一价离子的碱性低离子强度介质中，膜能自发地凹陷(无Mg“存在)或外凸(有Mg“存在)，形成小囊泡，通过实验可制备封闭的红胞膜囊泡。其特点是不受胞浆内容物的干扰，可采用匀浆，等密度梯度离心或屏障分离等技术制备胞浆面在外的翻转泡(其内、外层正好与血影膜相反)或胞浆面仍在内的正转泡(即与红细胞膜内外侧相同的囊泡)。 3．脂质体的制备

脂质体是双层脂质包围一些水溶液的小滴，呈球形。它是最常用的人工膜之一，是较为理想的生物膜模拟系统。大脂质体制备可将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂，置于旋转蒸发仪上蒸发至干，使玻璃壁上附有一层极薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振摇，即可形成多

层大脂质体。用超声波法和微量注射法、去垢剂法可获得单层脂质体。

4．突触体膜的制备

制备突触体膜的基本原理是将脑组织在预冷的蔗糖溶液中进行匀浆，再利用脑突触体膜的蛋白质与脂的比例、电荷性质、颗粒大小、形状等不同于其他的细胞器膜进行蔗糖密度梯度离心，将其分离出来。

二、微粒体的制备

微粒体是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于微粒体含有代谢外源化合物的混合功能氧化酶，在毒理学研究中有着重要地位，是较常见的试验模型。制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、凝胶过滤法及等电点沉淀法。

基本步骤为：将肝组织匀浆后，2500g离心；弃去沉淀(主要是细胞核及碎片)，取上清液9000g离心；弃去沉淀(主要是线粒体)，取上清液，100 000g离心，得到的沉淀即为线粒体，上清液为胞浆。所得微粒体用缓冲液悬浮后，贮存在一20～一70℃冰箱中。

除超速离心法制备微粒体外，用凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法也可以制得微粒体。

三、线粒体的制备 1．肝脏线粒体的制备

所有操作应在低温条件下进行。全部器械如匀浆器、烧杯、离心管等，以及缓冲液应放4℃冰箱内预冷。 2．亚线粒体颗粒的制备

亚线粒体颗粒是指经特殊处理，除去线粒体外膜和基质部分后形成的小囊泡。它含有氧化磷酸化过程所有的酶类，是观察呼吸链氧化反应、ATP酶活性及其他一些特殊反应的模型。

亚线粒体颗粒制备的原理是利用超声波作用，破坏线粒体外膜，再经超速离心获得仅有内膜的亚线粒体颗粒。在超声处理过程中应注意保持线粒体制备物温度，不要升高，维持在4℃以下。

第二节 核酸的提取与制备

核酸的提取是分子生物学中很重要的基本实验技术，也是其他分子生物学分析方法的前提条件。核酸样品的提取质量将直接关系到有关分析检测的成败。

分离纯化核酸总的原则是应保证核酸一级结构的完整性及排除其他分子的污染。为了保证孩酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。核酸的一级结构还决定着其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。

经纯化的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度，此外还要排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。 为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意：

①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。

②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在DH4～10的条件下进行。

③减少物理因素对核酸的降解。物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。机械剪切作用的主要危害对象是对分子质量大的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子质量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些。高温，如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，常规操

作温度为0～4℃，此温度环境可降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解。

④防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破环核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价离子Mg“，ca“的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、吸易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害习素。

总的来说，核酸提取的主要步骤就是破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。

核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。 一、DNA的提取与制备

从细胞中提取DNA要用尽可能温和的细胞破碎法，以免DNA被机械破碎。操作时还需要有EDTA的存在，以螯合镁离子，镁离子是DNA酶降解DNA所必需的。如果有细胞壁，要用酶进行消除，如用溶菌酶处理细菌，对于细胞膜要用去污剂溶解。对于不同来源的细胞、组织应使用不同的裂解液，如果必须使用物理破碎，一定要尽可能地轻缓。细胞破碎以及其后的操作都要在4cIC条件下进行，所用的玻璃器皿和溶液都要经过高压灭菌以破坏DNA酶。

上述方法只适用于细胞总DNA的提取。不同来源的样品，处理时有不同的注意事项。对于新鲜动物组织脏器等提取材料，由于含有较丰富的DNA酶，应迅速冷冻保存备用，以减少DNA的降解；石蜡包埋组织块中DNA应先进行脱蜡处理；培养细胞裂解之前应用相应的缓冲液进行洗涤；质粒DNA提取之前先要经过细菌培养，获得对数生长后期的细胞后进行离心集菌收集，再通过碱性裂解法、去污剂法或煮沸法等进行提取，纯化过程也可使用酚／氯仿萃取法，对于小分子DNA(小于10kb)，可用涡旋混合器以保证溶液中有机相与水相混合均匀，当纯化DNA分子介于10～30kb时，应轻微振荡，避免DNA被机械剪切，小于30kh的DNA分子纯化时应更小心。

二、RNA提取与制备

RNA提取技术与上述DNA提取技术相似。由于RNA分子相对较短，不易被剪切力损伤，因此细胞破碎可以用较强有力的方法。RNA对RNA酶敏感，而RNA酶在自然界广泛存在，不仅各种细胞内都有RNA酶，操作者的手指上也有RNA酶，因此操作者必须带手套，并且提取液中要有较强的去污剂存在，以便快速灭活RNA酶。接下来的去蛋白操作须特别强有力，因为RNA常常和蛋白质紧密结合在一起。用DNA酶去除DNA，用乙醇沉淀RNA。RNA提取要用硫氰酸胍．它既是较强的RNA酶抑制剂，又是蛋白变性剂。制备RNA时所用物品应完全无RNA酶。

第三节 基因突变分析与PCR检测

一、基因突变分析

基因突变(gene mutation)包括碱基置换、移码突变和片段突变(参见第五章第二节)。基因突变是分子水平的变化，在光学显微镜下无法看见，一般是以表型(如生长、生化、形态等)的改乏为基础进行检测的，也可通过DNA测序、DNA单链构象多态分析(sscP)、基因差异分析及基因芯片检测等分子生物学方法检测DNA序列的改变来确定。 1．PCR—SSCP技术

聚合酶链反应——单链构象多态性分析 在能够检测单个碱基变化的技术中，单链构象多态性分析因其简单而有效已成为最常用的技术。

(1)PCR—SSCP的基本原理

PCR～SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳。此时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链的碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链，其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。靶DNA中如含单碱基置换或数个碱基插入、缺失等改变时因迁移率变化会出现泳动变位(mobility shift)，从而可将发生突变的DNA与正常DNA区分开。

经典的PCR—SSCP技术采用放射性同位素标记引物或核苷，再通过放射性自显影显示结果。但由于放射性同位素的污染及半衰期的问题，限制其推广应用。现已发展多种PCR—SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，使用荧光素代替核素进行标记，也可以在电泳后用银染(银

染显示法也称冷sscp)。银染法利用对单链DNA亲和力较强的特点，大大提高了分辨率剂检测的敏感性，且技术操作简单、可重复性好，单链带型清晰，带与带之问易于识别，既避免了污染，又提高了灵敏性。此外，使用RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度，尤其是对大于200．b．p的片段检测更显优势。RNA分子形成的构象稳定、种类多，对单碱基置换等改变敏感，RNA的sscP分析可检出多条单链带，提高基因变异检出率，是PCR—SSCP技术又一发展方向。

（2）PCR—SSCP的优缺点

PcR—sscP优点包括：技术原理明确，操作简单，不需特殊仪器，技术容易掌握；实验步骤少、速度快、周期短；检测灵敏度高，一般无假阳性结果；可运用于大样本筛查；可有效检测单碱基置换和多碱基插入、缺失等基因突变类型。

但PCR—SSCP也存在一些不足之处： 1）、该方法最突出的问题是不能检测出所有的突变，由各实验室报道的突变检出率从35％一99％不等，且分析片段太小，可能呈假阴性结果。由于随DNA片段大小的增加迁移率的改变明显减少，故该方法只适用于检测150～200bp的DNA片段。一般来说，小于200bp片段的检出率可达90％，而大至400bp的片段，其检出率只有70％80％，片段越小，检出率越高。

2）、SSCP分析影响因素较多。凝胶浓度和交联度、电泳温度、凝胶中甘油的浓度、电泳缓冲液的离子强度等均可通过影响DNA单链构象从而影响DNA单链的电泳迁移率，一种PcR产物单链的良好的电泳条件需要反复试验摸索。

3）、PCR-SSCP分析只能发现是否有突变或碱基序列组成方面的变化，并不能了解DNA序列变化的性质及位点。解决问题的方法是将已知有改变的样本的PCR产物进行DNA序列分析．即PCR、SSCP、DNA测序三种方法的联用(PCR—SSCP—DNA—Sequencing技术)。

2．DNA测序

基因突变检测的“金标准”是直接进行DNA测序，一些基因突变筛选方法得出的结论往往还需DNA测序来证实。

经典的DNA测序就其原理来说主要分为化学降解法和Sanger双脱氧链终止法。在此基础上又发展了一些基于非放射物质标记和自动化测序的方法，近年来还发展了一些全新的DNA测序方法，如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法等以及不用电泳分离直接测序技术，如杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测法等。

(1)化学降解法

1977年．Ma。am和Gilb。rt报道了通过化学降解测定DNA序列的方法，即化学降解法(chem‘．。l cl。a。。ge m。thod，也叫M．dxam—Gilbert法)。它的原理是用一些特殊的化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，分别作用于DNA序列中4种不同的碱基，使其在核苷酸序列中形成的糖苷键连接变弱，易从DNA链上脱落下来。丢失了碱基的核苷酸链再经适当处理，就可在缺失碱基处断裂。在进行这些反应时，将反应条件控制在每条DNA链断开一处，因此经过处理可产生一系列长短不等的DNA片段。根据所用的试剂不同，其末端分别为G，A，C，T，再对一系列这样的片段进行电泳及放射自显影，综合分析，就可测得DNA分子中的核苷酸排列顺序。

(2)酶促双脱氧链终止法

酶促双脱氧链终止法又叫Sanger法或链终止法(chain termination method)。由于这种方法要求使用一种单链DNA模板和一种合适的DNA合成引物，因此有时也叫引物合成法或酶催引物合成法。其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2'3’一双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参与到寡核苷酸链的3’一末端，从而终止DNA链的生长。在同一反应管中加入链终止剂2’，3’一双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)中的某一种，以及引物、模板、dNTPs。ddNTP能随机掺人合成的DNA链，一旦掺入，DNA合成即终止，于是各种不同大小的片段起始端相同，而末端核苷酸必定为该种核苷酸。经电泳及放射自显影可从图谱上直接读出DNA序列。双脱氧法极适于大规模测序。

(3)自动化测序法

Sanger双脱氧链终止法和Maxam—Gilbert化学修饰法在DNA测序原理上是公认的两大成就．但两者也都存在着一些共同的问题有待解决。例如，这两种方法都需要使用放射性核素作为标记物，尽管灵敏度很高，但存在辐射危害，而且放射性材料在保藏、处理和运输方面也是相当麻烦的。再如，这两种DNA序列分析法都存在着操作步骤繁琐、效率低、速度慢等缺点(特别是在结果的判断环节中)。自DNA序列分析技术问世不久，为适应大规模测序的需要，许多科学家开始致力于DNA分析自动化方面的研究。自动测序仪的原理沿用Sanger等建立的双脱氧链终止法．DNA聚合酶催化延伸反应产生的DNA片段仍需通过序列胶电泳分离，采用荧光标记取代放射性标记，通过激光激发荧光，并与电子计算机程序的自动化技术相结合，达到自动检测碱基的目的。而在荧光染料标记方式上，美国应用生物系统公司ABI公司(applied biosystem)的自动DNA序列测定仪采用4种荧光基团标记，而欧洲分子生物学实验室(EMBL)与瑞典Pharmacia—ILKB公司联手推出的全自动激光序列分析仪(A．L．F．，automated laser fluorescent sequencer)则采用了单种荧光素标记。

使用DNA自动测序仪，熟练的操作者一天可以测1000个以上的碱基，而其他测序方法一般1人1年只能测50 000个碱基。这种方法因采用电子计算机控制，自动化操作，大大缩短了测定时间，而且结果准确可靠，是目前最优越的测序方法。

(4)DNA测序的新方法

分子生物学技术的发展日新月异，除了上述DNA测序方法，近年来又发展了一些全新的DNA测序方法。

①以凝胶电泳为基础的测序方法

在传统聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上又发展了毛细管电泳激光荧光法、超薄层板电泳激光荧光法等技术。

毛细管凝胶电泳比传统凝胶电泳分离速度提高了25倍，但1只毛细管只能分离1个样品，因此分析效率并未提高。阵列毛细管电泳新方法的出现提高了分析效率。1992年，美国科学家采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1．5h

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