实验一,3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定

实验一 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法

一、实验目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、实验原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1． 实验材料

小麦面粉；广范pH试纸。 2． 主要仪器

（1）大试管：2×20cm×14 （2）烧杯：100mL×3 （3）三角瓶：100mL×1 （4）容量瓶：100mL×3

（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4 （6）吸耳球、玻璃棒 （7）恒温水浴锅 （8）漏斗、滤纸 （9）白瓷缸、电炉 （10）精度天平

（11）分光光度计 3． 试剂（已制备）

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。

（3）6mol/L HCl和6mol/L NaOH 。

四、操作步骤

1． 制作葡萄糖标准曲线

取7支2×20cm大试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖含量 （mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1mg/mL葡萄糖标准液 （mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水 （mL） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS （mL） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 吸光度值 （A540） 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用流动水冷却至室温，用蒸馏水补充至20mL（即各加入16.5mL蒸馏水），震荡混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2． 样品中还原糖和总糖的测定 （1）还原糖的提取

准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液用100mL容量瓶定容，混匀，过滤，滤液作为还原糖提取液，待测。 （2）总糖的水解和提取

准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6mol/L HCl，置沸水浴中加热水解30min。待三角瓶中的水解液冷却后，用6mol/L NaOH中和（大约10mL左右），用广范pH试纸测试中和到pH=7，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液1 mL，移入另一9mL水的试管中，混匀，稀释10倍 作为总糖待测液。 （3）显色和比色

取7支2×20cm大试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，用7号管进行空白调零。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

表2 样品还原糖测定 管 号 7 8 9 10 11 12 13 还原糖待测液 （mL） 1.0 1.0 1.0 总糖待测液 （mL） 1.0 1.0 1.0 蒸馏水 （mL） 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 DNS 吸光度值 （mL） （A540） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 查曲线葡萄糖量 （mg）

五、结果与计算：

利用8、9、10号管吸光度值和11、12、13管吸光度值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，分别计算出还原糖和总糖的平均值，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

查曲线所得还原糖毫克数×稀释倍数

还原糖（%）= ×100

样品毫克数

查曲线所得总糖水解后毫克数×稀释倍数

总糖（%）= ×0.9×100

样品毫克数

六、注意事项

1． 试管、烧杯和三角瓶事先要洗净烘干。 2． 试管要提前标号。

3． 移液管使用前要润洗。 4． 移液管要专管专用。

5． 分光光度计要预热30分钟。

6． 比色皿要用擦镜纸擦干，尤其是光滑面，更不能用手碰。 7． 保持环境干净，废液倒在废液缸中，废纸放入垃圾桶中。

8． 标准曲线制作与样品测定尽量同时进行显色，并使用同一参比溶液调零点和比色。

9． 用分光光度计比色时，应注意每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，再用待测液润洗，之后再

装待测液。

七、思考题

1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的? 2．比色测定时为什么要设计空白管？

八、预习题

1. 什么是还原性糖

2. 高中学过测定还原性糖的方法是什么？其原理和操作又是什么？

3. 操作注意：注意事项中要求，用分光光度计比色时，每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，这

是为什么？如果不洗会造成什么影响？

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