ROS是植物环境胁迫信号中最重要的物质

ROS是植物环境胁迫信号中最重要的物质

Aaron Baxter, Ron Mittler and Nobuhiro Suzuki*

摘要

活性氧簇（ROS）是植物体内的一类信号分子，在植物体生长、发育和对生物与非生物刺激的应激反应等生理活动的调节过程中扮演着不可或缺的角色。呼吸爆发氧化酶系（RBOHs）是一种主要作用于植物体内与环境胁迫有关的组织与细胞信号转导路径的酶系。ROS信号分子功能的多样性某种程度上应该归于（RBOHs）调节机制的多样性。最近的研究表明，植物的环境胁迫反应是由ROS和一些在胁迫反应化合物、复合物及激素合成过程中产生的其它信号分子协同介导的。在这篇综述里，我们将通过对植物信号通路研究成果的整理来展现ROS信号的最新研究成果。更重要的是，我们还将指出是哪些信号分子赋予植物系统获得性抗性（SAR）和系统获得性适应性（SAA）。

关键词：活性氧簇（ROS），呼吸爆发氧化酶系（RBOH）,胁迫反应，系统获得

性适应性（SAA），系统获得性抗性（SAR），时空协同。

前言

活性氧簇（ROS）信号体系在耗氧组织十分活跃，并且控制着植物诸如生长、发育和对生物与非生物刺激应激反应等生理过程（Mittler et al.,2011）。之前的研究主要集中于ROS的潜在毒性和ROS的清除机制，最近的研究更多地集中于ROS作为信号分子的作用。若ROS是信号分子，则必然存在将ROS保持在最大无毒浓度之下的机制，这包括催化产生ROS的酶及细胞代谢生成ROS的过程和ROS清除过程(Mittler et al., 2004).。在植物体内，NADPH氧化酶，呼吸爆发氧化酶系，在ROS生成体系中扮演着关键角色(Torres and Dangl, 2005; Suzuki et al., 2011)。在拟南芥中，RBOHs是一个多基因家族，由10个基因组成(i.e. AtRBOHA–AtRBOHJ)。近些年，部分研究表明植物RBOHs在许多过程中发挥作用，包括根毛生长、气孔关闭、受粉、植物抗性和对生物胁迫的反应(Torres et al., 2005; McInnis et al., 2006; Monshausen et al., 2007; Jammes et al., 2009; Miller et al., 2009; Nishimura and Dangl, 2010; Suzuki et al., 2011)。

植物不同类型组织，不同环境条件下的许多生理过程都受到ROS和其它信号分子的时空协同调节。在植物胁迫刺激反应中，早期的信号反应包括流向细胞液的Ca2+量增加，有丝分裂刺激原蛋白激酶（MAPKs）的激活，和蛋白质的磷酸化 (Benschop et al.,2007)。这些调节机制都能在数秒或数分钟内完成(Benschop et al., 2007; Miller et al., 2009; Finka et al., 2012)。这些信号之后，控制表型变化的长效作用将随之发生，这些表型变化包括细胞的生长、发育和生存(Torres and Dangl, 2005; Coupe et al., 2006; Muhlenbock et al.,2008; Pesaresi et al., 2009; Dubiella et al., 2013)。ROS在这些短期和长期反应中的作用被认为是体现在ROS

的爆发分泌过程，这种爆发过程伴随不同的信号反应形成不同的峰值(Nishimura and Dangl, 2010; Mittler et al., 2011)。此外，RBOHs的组织细胞特异性共表达说明ROS的组织细胞特异性与信号分子组织细胞特异性存在某种程度的关联(Suzuki et al., 2011)。

最近的发现强调细胞间交流在介导植物时空信号调控的关键作用。对于无柄有机体，植物逐渐形成很好的环境适应性和防御机制，这些适应机制既能发生于植物体受到环境胁迫的组织，也能发生于未受环境胁迫的组织(Fig. 1)。这种存在于系统性或无缺陷组织的防御或适应机制分别被称为系统获得性抗性（SAR）或系统获得性适应性（SAA），并且都在避免植物体受不利环境危害的过程中发挥重要作用(Karpinski et al.,1999; Rossel et al., 2007; Carr et al., 2010; Szechynska-Hebda et al., 2010; Dempsey and Klessig, 2012; Spoel and Dong,2012; Shah and Zeier, 2013)。将ROS包括进植物系统性信号系统，这个在植物免疫、损伤反应和强光适应性的过程中发挥作用的系统，最早是是十几年前由by Alvarez et al. (1998), Orozco-Cardenas and Ryan (1999)分别提出的。我们最近发现了一个可被多种非生物刺激激活的依赖于H2O2的远距离信号体系(Miller et al., 2009)。研究表明，RBOHD对于快速细胞间系统性信号传递的起始和增强是非常重要的，而RBOHD依赖于细胞间隙中H2O2的积累以形成‘ROS’波动(Mittler et al.,2011)。另外，我们证明ROS波动在植物SAA中的重要生物学功能是应对高温和强光胁迫(Suzuki et al., 2013)。我们的研究表明ROS的功能是作为植物通用的起始信号，向植物全身组织发出非生物胁迫出现的警告。此外，我们发现植物对非生物胁迫产生SAA是通过ROS波动和植物全身组织受刺激产生的胁迫特异性激素或氨基酸信号之间的时空相互作用实现的。

从这个角度来说，我们将对ROS和其它介导植物体胁迫反应（比如SAA和SAR）的信号之间时空协同的一系列发现提出新的看法。我们也将努力解释一个关键问题，即植物对不同环境胁迫的特异性反应的机制是什么。

RBOH蛋白的调节机制

植物的RBOHs在C-末端含有胞质FDA-和NADPH结合位点，以及6个保守的跨膜区，这与哺乳动物NADPH氧化酶相对应 (Kobayashi et al., 2007; Lin et al., 2009; Glyan’ko and Ischenko, 2010; Proels et al., 2010; Kimura et al., 2012)。与哺乳动物不同的是，植物RBOHs有一个由两个结合Ga2+的 EF手性motifs构型和磷酸化目标位点组成的N-末端，这对于其活性至关重要(Kobayashi et al., 2007; Oda et al., 2010; Kimura et al., 2012; Drerup et al., 2013)。一旦启动，在非原质体中，经RBOH蛋白作用产生超氧化物(O2–)，随后自发地，或在SOD的催化作用下转化为H2O2(Lin et al., 2009; Wiet al., 2012)。H2O2可以透过细胞膜，随后在新陈代谢过程（如生长、发育和对环境的应激反应）的调节中作为信号分子发挥作用(Sagi et al., 2004; Xia et al., 2009)。

拟南芥的某些RBOH蛋白簇的调节机制(e.g. AtRBOHC, D, and F) (Fig. 2)已经进行了研究。这些机制需要多种信号物质（蛋白质磷酸化、Ca2+、钙依赖性蛋白激酶和Dα1磷脂酶）共同作用(Lin et al., 2009; Monshausen et al., 2009; Zhang et al., 2009; Jakubowicz et al.,2010; Drerup et al., 2013; Dubiella et al., 2013).。对植物组织的机械刺激通过促进Ca2+经质膜内流引起细胞质Ca2+浓度的升高(Monshausen et al., 2009)。升高的Ca2+浓度激活RBOHC依赖性ROS产生， Ca2+浓度与RBOHC依赖性ROS之间相互促进，共同完成根毛发育的调节(Monshausen et al., 2007,2009; Takeda et al., 2008)。最近的研究发现RBOHD和RBOHF之间调节机制的不同。Ca2+的结合与磷酸化作用共同完成拟南芥体内RBOHD和RBOHF过程中ROS合成的激活(Ogasawara et al., 2008; Kimura et al., 2012)。胞质中Ca2+浓度的升高对RBOHD的激活是必需的，而且这一激活还需要通过Ca2+的结合使EF手型motifs序列构象

发生改变(Ogasawara et al.,2008)。PLDα1和它的脂化产物磷脂酸（PA）在植物借RBOHD和RBOHF的功能实现脱落酸（ABA）介导ROS产生的过程中是必需的(Zhang et al., 2009)。RBOHD中与PA结合的motifs序列（在149、150、156和157位点是精氨酸残基）对于ROS的产生和气孔的关闭时必需的。RBOHF也被发现磷酸化了，不过是被OPEN STOMATA 1 (OST1)在Ser174和Ser13位点磷酸化的，这一过程发生于ABA依赖气孔关闭的过程中(Sirichandra et al., 2009)。虽然这些发现表明RBOHD和RBOHF在调节ABA依赖气孔关闭过程中是综合作用的，PA与OST1的协同作用仍需进一步的研究。最近的研究表明，RBOHD是在抵御病原体的过程中被钙依赖蛋白激酶5（CPK5）催化而磷酸化的(Dubiella et al., 2013)。RBOHD参与植物快速全身性信号反应需要H2O2和CPK5的协助，这一结果支持了Ca2+依赖性ROS产物参与ROS波动的长距离传输的假说(Miller et al., 2009)。此外，最近的研究表明RBOHF活性的调节是通过Ca2+与EF手型序列的直接结合以及CBL1/9–CIPK26复合体协助的Ca2+依赖性磷酸化实现的(Drerup et al., 2013)。总地来说，这些发现表明植物体内RBOH信号的传递功能，即使不是全部，也至少部分地因为调节机制的不同。

其它植物种类和农作物的RBOH蛋白的调节机制也有研究。哺乳动物Rac的同源物，存在于水稻中的OsRac1被发现在水稻抵御病原菌的过程中作为OsRBOHB的有效调节物发挥作用(Wong et al., 2007; Oda et al., 2008)。OsRac1在Ca2+协助下作用于OsRBOHB的N-末端EF手型motif序列，从而激活OsRBOHB。OsRac1对ROS产物的重要性已被实验验证，活化或失活形态的OsRac1可分别促进或抑制ROS的功能(Ono et al., 2001; Wong et al., 2007)。在土豆体内，两种钙依赖蛋白激酶，StCDPK4 和 StCDPK5对StRBOHB依赖的ROS产生具有激活作用(Kobayashi et al., 2007)。两个磷酸化位点，Ser82 和Ser97,，在StRBOHB的N-末端被鉴定出来，并且磷酸化位点Ser82对于在抵御病原菌过程中的呼吸爆发是非常必要的(Kobayashi et al., 2007)。另外，StCDPK5 N-末端的可变区域，包括豆蔻酰化和棕榈酰化修饰位点，令StCDPK5居于细胞特定位置，从而使其与StRBOHB和StCDPK5相互作用，即植物体内StRBOHB被磷酸化(Asai et al., 2013)。在辣椒（Capsicum annuum）体内，受体样蛋白激酶1（CaRLK1）的产生是由病原菌感染和外源性H2O2刺激引起的进(Yi et al., 2010)。导入CaRLK1基因并表达的转基因植物表现出更强的抗病性和更少的细胞衰亡，同时的O2–

的产生和RBOH基因的表达都有增强(Yi et al., 2010)。综上所述，数种在不同作物中被发现的RBOH蛋白，其调节机制与拟南芥中的RBOH蛋白的调节机制有明显的不同。那么RBOH调节机制在不同植物之间，在多样的环境中是否高度保守就是一个很值得研究的问题了。

RBOH蛋白簇并非植物细胞内唯一的ROS产生途径。植物体内存在很多ROS的产生路径，包括光合作用（通过电子传递链和光系统I和II）、呼吸作用（通过电子传递链）、葡糖酸氧化酶、草酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胺氧化酶、激活的叶绿素ll、脂肪酸氧化过程和过氧化物酶系(Mittler, 2002)。不同的氧化酶在植物应对生物与非生物胁迫的过程中扮演重要角色。研究发现，草酸氧化酶在干旱条件下植物根毛细胞中ROS的产生过程中发挥作用(Voothuluru and Sharp, 2013)，此外，葡糖酸氧化酶（GOX）在烟草和拟南芥对非寄生性致病菌的抵御过程中扮演着重要角色(Rojas and Mysore, 2012; Rojas et al., 2012)。过氧化物酶也在植物防御反应的ROS产生过程中发挥作用。过氧化物酶33（PRX11）和PRX34已被证明在拟南芥对真菌细胞壁激发子和细菌性病原菌的反应过程中发挥主要作用(Daudi et al., 2012; O’Brien et al., 2012b; Wrzaczek et al., 2013)。过氧化物酶依赖性ROS在胼胝质的沉积和防御基因的表达中发挥作用(Daudi et al., 2012; Wrzaczek et al., 2013).。有大约一半病原菌诱发的H2O2生成是由过氧化物酶催化的(O’Brien et al., 2012b)。有趣的是，与rbohD植物相比，PRX被抑制的植物体在抵御真菌入侵时表现出防御基因表达和胼胝质生成上更大的缺陷。说明由过氧化物酶催化合成的ROS与RBOH蛋白催化合成的ROS并非等效的(Daudi et al., 2012;

Wrzaczek et al., 2013)。这个假说得到下面这个研究的支持，在拟南芥中，由酵母激发子引起的气孔关闭和ROS爆发并没有因为rbohD和rbohF的突变而被抑制(Khokon et al., 2010)。另外，最近的研究发现，过氧化物酶催化合成的ROS在调节根部生长和应对钾匮乏的过程中具有作用(Kim et al., 2010; Jia, 2011; Kwasniewski et al., 2013).。ROH蛋白与过氧化物酶之间的综合作用是未来的研究重点。

RBOH蛋白和过氧化物酶功能的不同有一部分原因可能是两种酶催化产生的ROS并非

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同种物质。由RBOH催化产生的超氧根离子（O2）能激活特定的信号通路，其激活的信号通路与双氧水（H2O2）激活的明显不同(Suzuki et al.,2011)。它们功能不同的另一个可能原因是它们各自还原剂的不同。NADPH是RBOH催化产生超氧化物的还原剂。相反地，许多化学物质，比如苯酚、有机酸和生长素都能作为过氧化物酶催化合成H2O2的还原剂(O’Brien et al., 2012a)。通过这些酶功能的不同可将消耗不同还原剂的反应路径和ROS信号激活的后续反应整合起来。

植物ROS信号的时序协调

在植物发生转导和环境适应性之前，环境条件的变化首先引起植物不同代谢过程、蛋白质和RNA分子在水平、组分和结构上的迅速变化。早期的信号包括离子的跨质膜流动、原生质内Ca2+浓度的升高、MAPKs的激活和ROS的产生。这些信号都能在植物受到生物或非生物刺激后的几分钟内产生(Benschop et al., 2007; Miller et al., 2009; Finka et al., 2012)。例如，烟草细胞中ROS的产生可在其受到高温胁迫后3min以内产生，这一过程可被NADPH氧化酶抑制剂所抑制(Konigshofer et al., 2008)。质膜上的钙离子通道已被确认是高温胁迫感受器之一(Saidi et al., 2009; Finka et al., 2012; Mittler et al.,2012)。植物被置于高温环境时，钙离子通道将在10,min内进行一次短暂地开放并使钙离子向细胞内流动(Saidi et al., 2009; Finka et al., 2012)。这一Ca2+信号可能与ROS合成酶的调节机制有关(Mittler et al., 2012)。利用磷酸化蛋白组学方法，研究者们证明，当拟南芥悬浮培养的细胞置于高温环境中时，病原菌激发子、fla22激活MAPKs，导致包括离子通道、钙调蛋白、蛋白激酶、蛋白磷酸化酶以及与生长素信号结合的蛋白质在内等膜蛋白和RBOHD将在5-10min内被磷酸化(Benschop et al., 2007)。另外，植物体内的CDPKs在植物受到生物刺激后的数分钟内被激活，并参与植物早期的防御反应(Ludwig et al., 2005; Kobayashi et al., 2007; Boudsocq and Sheen, 2013)。在植物叶片未受病原菌激发子和flg22直接作用时，AtRBOHD的CPK5依赖性在体磷酸化将在15min后发生(Dubiella et al., 2013)。

植物在强光胁迫下的早期反应也已经被研究并描述了(Karpinski et al., 1999; Rossel et al., 2007; Muhlenbock et al., 2008; Szechynska-Hebda et al., 2010; Gordon et al., 2012)。研究者利用含有受APX1、APX2或ZAT10启动子控制而表达的荧光素酶报告基因的转基因植物研究证明，无论是受到强光照射的叶片，还是未受强光照射的末梢组织都将在5-20min内被激活环境适应性(Karpinski et al., 1999; Rossel et al., 2007; Szechynska-Hebda et al., 2010)。这些应对强光照的反应伴得到质体醌（PQ）池的氧化还原的协助，增大了ROS和乙烯的产量，降低了最大光化学效率和非光化学淬灭系数（NPQ），改变了细胞外电势(Karpinski et al., 1999; Rossel et al., 2007; Szechynska-Hebda et al., 2010)。

研究还表明植物受机械损伤时也会发生快速反应。当拟南芥受到机械损伤时，植物30s到5min之内全身叶片都将积累茉莉酸，而不是局限于受损伤部位(Glauser et al., 2009; Koo et al., 2009)。在其从头合成茉莉酸的组织中，长距离传输信号的传输速度是3.4-4.5cm·min-1 (Glauser et al., 2009; Koo et al., 2009)。最近的研究表明，NADPH氧化酶簇RBOHD对于自动传送的全身性信号体系（autopropagating systemic signal）的产生和放大是分厂重要的，这

一信号系统传输速度约8.4 cm·min-1，并且可被包括机械性损伤在内的多种非生物刺激所激活(Miller et al., 2009)。另外，植物损伤应对过程中，与电信号关联的电势信号传输速度与全身性信号体系（autopropagating systemic signal）相当，它也与RBOHD触发的快速反应信号系统紧密相关(Zimmermann et al., 2009; Mittler et al., 2011; Suzuki and Mittler, 2012).。这些发现意味着JA与ROS和电信号之类的传输信号是协同作用的。

我们最近的研究表明依赖RBOHD的长距离传输信号在植物应对高温和强光胁迫时的SAA反应中发挥重要作用(Suzuki et al., 2013)。所谓SAA，是一种增强植物高温适应性的生理反应，其与ROS波动的激活紧密关联，也在高温胁迫发生后的5-10min内产生。此外，代谢物组的分析显示，若叶片暴漏于强光下60s，其甘氨酸、丝氨酸和甘油酸将迅速积累，而同样的反应在其他组织中却需要15-45min才出现，这表明光呼吸组分参与了植物对强光的应对过程。植物对强光的快速局部反应在APX1基因突变导致缺乏溶于细胞质的APX1时将被抑制，这表明这一过程中发生了H2O2的消耗。

植物对变化环境的长期应对方式是调节表型的变化，比如生长、发育和细胞存活与凋亡。比如，植物受ROS协助的防御机制在病原菌感染后的数小时和数天内提供保护(Torres et al., 2005; Muhlenbock et al., 2008; Dubiella et al., 2013)。由RBOH蛋白介导的ROS积累也能在病原菌感染后数小时或数周内观察到，此时ROS积累表现出与缓慢地坏死症状协同作用(Kobayashi et al., 2007; Wi et al., 2012)。

发育中的叶片相对于成熟的叶片暴露于变化的光照和大气CO2浓度下的时间较短，适应性较差，但在生长和发育过程中，其光合速率会逐渐恢复，对强光的忍受力也将逐渐增强。(Coupe et al., 2006; Araya et al., 2008; Jiang et al., 2012)。尽管光合速率、ROS协助的强光应激反应和氧化还原信号在植物新生叶片对强光的应对过程中交互作用，ROS信号和上述反应之间的联系还没有确定的研究结果。质体中ROS信号受到PQ池氧化还原状态的调节，这在植物适应光强浮动的过程中发挥重要作用(Muhlenbock et al., 2008; Li et al., 2009; Mittler et al., 2011)。光质的变化可造成光系统间能量失衡，并在数小时至数天的时间里通过SNT7激酶的作用导致类囊体成分的改变(Pesaresi et al., 2009)。

植物应对胁迫环境的快速反应和长期反应是如何联系起来的呢？早先的研究证明植物产生的ROS是两相的，第一相在数分钟内出现，而第二相则在数小时至数天内出现(Soares et al., 2009; Nishimura and Dangl, 2010; Kunihiro et al., 2011; Mittler et al., 2011)。这中两相的ROS产物与植物体内多种生物系统的信号分子协同作用(Soares et al., 2009; Nishimura and Dangl, 2010; Mittler et al., 2011)。例如，机械损伤发生后的3分钟内出现O2-的初始爆发性合成，而在6小时后出现O2-和H2O2的产生(Soares et al., 2009)。用NADPH氧化酶抑制剂抑制早期ROS的产生也将抑制随后O2-的合成和损伤应对蛋白的积累。这些结果表明早期ROS的爆发性合成对于第二次ROS的产生是必要的，而第二次ROS产生调节着下面的信号路径和植物对胁迫刺激的适应性。我们最近的研究表明这两相ROS爆发合成通过ROS波动相连接，ROS波动可将受刺激部位的ROS爆发通过细胞间传递的方式传输到植物的全身组织(Miller et al., 2009; Suzuki et al., 2013)。

植物体内ROS信号的空间协同

植物基因组，比如拟南芥，含有大量RBOH基因簇。最近几年，一些研究表明植物RBOHs发挥在各种组织和各个发育阶段发挥了大量信号分子的功能(Suzuki et al., 2011)，这意味着多种生物过程是通过植物不同类型组织中激活的不同ROS的协同作用实现的。

某种程度上来说，植物SAA过程中，刺激部位与全身其它部分产生的信号不存在不存在差别。Rossel et al. (2007)论文中将受刺激叶片（直接暴露于强光下的叶片）和全身其它叶

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